超强总结！食品微生物检验知识要点（二）来啦！

莺歌燕舞

目录
一、无菌技术
二、微生物的接种与分离技术
三、细菌的培养方法
四、细菌的生长现象
五、细菌的生化反应检查法

4细菌的生长现象
(一)细菌在固体培养基上的生长现象

1．细菌在营养琼脂平板上的生长现象  
细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体（群落），称为菌落。
一个单一的菌落原则上是由一株细菌生长繁殖而成，其特征代表了该菌种细菌的特性。
观察的方法是将平皿培养物放在自然光或白炽灯光的前面，从不同角度进行观察。



菌落形状：圆形、不整形、扁平、凸起、凹面
菌落大小：以mm计算。
表面性状：光滑、粗糙、有无光泽等。
边缘情况：整齐、不整齐、锯齿状等。
颜   色：无色、白色、黄色、灰色等。
透 明 度：不透明、透明、半透明等。
质   地：硬、软、脂状、磨状等。
粘   度：奶油状、黏液状、膜状易碎等。
乳 化 性：指在生理盐水中，将一菌落在盐水中研磨形成均匀乳状或颗粒状的程度。

菌落形态学（Bacterial Colony Morphology）



有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙；
具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。
没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等；





光滑型菌落



粘液型菌落



粗糙型菌落



单增李斯特氏菌在普通计数琼脂平板上的菌落

2．细菌在鉴定培养基上的特征
（1）在血平板上的溶血特征
α溶血：在菌落周围出现狭窄的草绿色的半透明区域，而红细胞外形完整。
β溶血：在菌落周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带。
γ溶血：看不到溶血带的溶血。



双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一部分溶血的圆圈。



(2)卵黄琼脂中的反应：
此培养基用于检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶，前者是在菌落周围出现一沉淀环，后者则是出现“珍珠包膜”，即在菌落周围出现“珍珠层”，通过反射光可见菌落周围有一层闪光膜。




乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，



(3)蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。
(4)色素：细菌在生长过程中可产生色素。
水溶性色素溶在培养基中，使培养基着色，如绿脓色素、荧光色素等；
脂溶性色素则使细菌菌落着上颜色，如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。



（5）气味：有些细菌在生长过程中可产生气味，有助于细菌的鉴定。
能产生特殊气味的细菌有：假单胞菌属细菌可产生葡萄汁气味；变形杆菌产生巧克力烧焦的臭味；链球菌产生地窖里的霉臭；梭菌可产生粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌产生辛辣味等。

(二)细菌在液体培养基中的生长现象
细菌在液体培养基中一般以培养18～24h，观察生长特性为好。细菌在液体中生长特性包括：
1．发育程度  以有无生长，微弱、中等、旺盛来表示。

2．浑浊度  有无浑浊以及浑浊的程度(一般以混、中等、微浑、透明表示)；均匀浑浊、有颗粒；絮状生长。

3．沉淀  细菌由于重力而下沉，如链球菌的链与链相互缠绕而下沉，出现肉眼可见的沉淀，而上层的液体仍清澈透明，或者由于发酵分解糖产生酸，而使基质中的蛋白质发生沉淀。

4．液体表面性状  有无表面生长以及生长的性状，如膜状(厚薄)、环状、皱状、是否光滑或呈颗粒状。

5．其他  有无色素，有无气味，有无产酸情况，有无气体产生。



(三)细菌在半固体培养基中的生长现象
半固体培养基主要用于细菌动力的观察：
有动力的细菌在穿刺线处有生长线外，在穿刺线的周围均可见浑浊和细菌生长的小菌落；

无动力的细菌仅在穿刺线上有生长，周围的培养基透明清晰。



5细菌的生化反应检查法
由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生化反应试验。

1、在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。
2、在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3、根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4、根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。

生化试验的注意事项

1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。
2、待检菌应是纯种培养物。
3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。
4、应做必要的对照试验。
5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。

生化试验分类
（一）糖类代谢试验
（二）氨基酸和蛋白质代谢试验
（三）有机酸盐和铵盐代谢试验
（四）酶类试验

(一)糖类代谢试验

1. 糖(醇)发酵试验

原理  糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自有不同的酶系统，故对糖(醇)类的分解能力不尽相同。有的能分解某些糖类，生成酸又生成气体，有的虽能分解这些糖类但只能生成酸不能生成气体，有的则根本不能分解。借此特点，可以作为鉴定细菌的依据之一。该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊的糖发酵(降解)后产酸或产酸产气的能力。

常用的糖、醇

单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖
三糖：棉子糖
多糖：菊糖、肝糖、淀粉
醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇

方法
(1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等。前二者颜色反应较敏感，但稳定性较差。后二者比较稳定。特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，则以后二者为优。

(2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖(或三糖)高层斜面发酵管。

(3)操作：以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌接种到糖(醇)发酵培养基中，置温箱内，按各类菌所要求温度(通常为37℃)经一定时间(数小时至二周)培养，然后观察结果。


结果
(1)接种的细菌，如能分解培养基中的糖(醇)类而生成酸，由于培养基内加有指示剂，故可使培养基中的指示剂呈酸性反应，如产生气体，则可使半固体培养基内或液体培养基中倒置的小管出现气泡。如若不分解则无任何反应。

糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。



记录：
产酸不产气，阳性，以“+”表示
产酸产气，阳性，以“⊕”表示
不产酸产气，阴性，以“-”表示

(2)在半固体糖发酵管中，还可以观察细菌的动力，若为有鞭毛的细菌，则沿接种线向周围扩散生长。若为无鞭毛菌，则仅在接种线处生长。


3)在双糖(或三糖)高层斜面发酵管中，由于葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，如细菌只分解葡萄糖，则斜面上产生的酸少，且易被氧化并因产生氨以及细菌分解培养基中的蛋白质产生碱性物质而变弱碱性，故斜面变为粉红色，而底层变酸，指示剂变色。若细菌分解葡萄糖，同时也分解乳糖或蔗糖时，则产酸量较多，底层和斜面均呈酸性，指示剂亦变色。若在此培养基中加入硫酸亚铁或尿素，同时还可以观察细菌产生硫化氢及尿素分解情况。



注意事项
(1)各种糖发酵培养基，含糖的浓度一般为5～10g/L，有时为20g/L。
(2)有些糖类，可因121℃高压蒸汽灭菌时水解变质，特别是在碱性溶液中更易被破坏，故含糖的培养基常用115℃，15min灭菌。亦可先将糖类单独配制成100～200g/L的水溶液，经115℃ 15min灭菌后，然后再以无菌操作的方法加入已灭菌的培养基中。此外，还可将糖的溶液用滤菌器进行滤过除菌，再加入培养基中。
(3)若应用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

2. 甲基红(MR)试验

原理  某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的酸类较少，培养基pH较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。
因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。

方法
(1)培养基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培养基)。
(2)试剂：甲基红指示剂。
(3)操作：待检菌18～24h纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中；37℃培养2～3d，每2ml培养液加2滴甲基红指示剂，立即观察。

结果  
MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色(pH4.4)；
MR阴性：培养基表面呈黄色(pH6.0)；
延迟反应：橙色，应继续孵育到4天，并重复试验。



3. 伏普试验(V-P试验)

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。



方法(Barritt法)
(1)试剂：甲液为60g/Lα－萘酚酒精溶液；乙液为400g/L KOH溶液.
(2)操作：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37℃培养4d。再按每2ml培养液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分摇动试管，观察结果。
结果  如立即或于数分钟内出现红色反应者为阳性；若为阴性应将试管置37℃中4h后再进行观察。

4. β-半乳糖苷酶试验

原理  细菌的酶分为结构酶和适应酶。β-半乳糖苷酶是一种诱导酶，它对半乳糖苷的作用是特异的。发酵乳糖的大肠菌类能产生β-半乳糖苷酶-渗透酶和β-半乳糖苷酶，因此能迅速地(在24～48h内)分解乳糖，并通过中间产物半乳糖和葡萄糖形成CO2和H2。非乳糖发酵菌缺少这两种酶，因此乳糖既不能进入菌体，又不能被分解。然而，不能发酵乳糖的细菌可呈现两种表型之一：一是G-P + ，即没有β-半乳糖苷酶(G)，但有渗透酶(P)，因此不能发酵半乳糖苷，但能积累半乳糖苷；二是 G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但没有渗透酶(P)。

通过使用有机化合物邻位-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)证明有无β-半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶阳性的细菌存在，无色的ONPG试剂被水解，释放出黄色化合物邻位-硝基苯酚(ONP)。阳性β-半乳糖苷酶试验就是基于对邻位-硝基苯酚的检测。

方法
(1)培养基：10g/L乳糖肉汤琼脂。
(2)试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液；邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)液。
(3)操作：首先将被检菌接种到10g/L乳糖肉汤琼脂上，经37℃培养过夜，以无菌方法取一接种环菌置于0.25ml的生理盐水中做成菌悬液，然后加ONPG液0.25ml，置于37℃温箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察结果。

结果  
如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈现黄色者为阳性；如无此酶则24h不变色。

5. 七叶苷水解试验

原理  某些细菌(如粪链球菌)可水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素(为一种珊瑚状的白色结晶)。七叶素可与培养基中的柠檬酸铁试剂的二价铁离子起反应生成黑色的化合物沉淀，使培养基变黑。


方法
(1)培养基：七叶苷培养基。
(2)操作：以无菌方法将试验菌接种到七叶苷琼脂斜面培养基上，经37℃ 18～24h培养，观察结果。
结果  培养基变黑色者为试验阳性。若将粪链球菌接种到七叶苷液体培养基中，经37℃ 4～6h培养，培养基即可。

6 石蕊牛乳试验

原理  牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均可在其中生长。一种细菌在石蕊牛奶中可表现一种或几种代谢特性，每种代谢特性对一个特定细菌来说都是特异的。这样，就有助于细菌的鉴定：①乳糖发酵；②石蕊还原；③凝固蛋白；④蛋白陈化(消化)；⑤气体产生。

有的细菌如产气荚膜梭菌，对牛乳具有强烈发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种被称为“汹涌发酵”是为该菌所特有。有的细菌不发酵乳糖，而分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。

方法
(1)培养基：石蕊牛乳培养基。
(2)操作：首先将培养基表面的一层凡士林在酒精灯上熔化，然后无菌取被检菌接种到石蕊牛乳培养基中。接种后将培养基直立，置37℃温箱培养，观察结果。

结果  
产酸：若发酵糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。产气：若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。凝固：若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若将凝固的酪蛋白，继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段则变清。产碱：若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。

（二）氨基酸和蛋白质代谢试验

不同细菌分解蛋白质能力不同，可利用不同氮源来合成菌体蛋白质，可通过检测加入蛋白质分解代谢后的产物或pH变化鉴定细菌。

1.靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。


方法
(1)培养基：蛋白胨水。
(2)试剂：Kovac试剂；欧氏试剂。
(3)操作：纯培养物接种蛋白胨水培养基35℃培养24～48h，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml，分为两层，观察。

结果  
两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。



2. 硫化氢试验

原理  某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S， H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。



方法与结果
(1)琼脂穿刺法：
培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。
操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37℃ 24h培养后，观察结果。
结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。


(2)醋酸铅试纸法：
培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。
操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37℃培养24～48h。
结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。

3. 尿素酶试验

原理  有些细菌(如某些变形杆菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨,使培养基pH上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。
方法
(1)培养基：尿素琼脂。
(2)操作：将待检菌接种于尿素培养基，37℃培养18～24h，观察结果，如为阴性应继续观察4d。

结果  培养基变红为阳性，不变为阴性。


1、尿素酶阴性  2、尿素酶阳性

4. 明胶液化试验

原理  某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。天然存在的蛋白质分子太大不能进入菌体细胞，因此，细菌为了利用这些蛋白质，首先必须将其分解为较小的组分。某些细菌分泌细胞外类蛋白水解酶(明胶酶)来分解蛋白质，这种能力有助于细菌的鉴定。

方法
(1)培养基：明胶培养基
(2)操作：将待检菌穿刺接种于明胶培养基，同时设置对照管(未接种细菌)，20℃培养5～7d，观察。在孵育期间，每24h取出试管(包括含细菌的试验管相对照管)放冰箱(或冰浴)内约2h，检查明胶是否已被消化(液化)，每天一次，直到7d，除非发生液化。有许多菌种要证实明胶液化需要延长孵育时间。

结果半固体培养基不再凝固为阳性。

注意事项:
明胶在≤20℃时为固体，≥35℃时则为液体。从凝胶(固态)转变为液体大约在28℃。所以，明胶管在≥35℃下孵育时，在决定是否液化以前，必须先放在冰箱或冰浴中冷却一段时间。因细菌在培养基的表面生长引起液化，当明胶管还温热时不要摇动，否则液化的明胶与培养基液体混合，由此忽略阳性结果，造成假阴性。

5. 苯丙氨酸脱氨酶试验

原理  某些细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离氨，加入FeCl3试剂与苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，随后绿色可褪去。延长时间后，所生成的绿色会较快褪色。苯丙酮酸如与柠檬酸铁相遇则产生棕黑色。

方法
(1)培养基：苯丙氨酸培养基。
(2)试剂：100g/L FeCl3溶液。
(3)操作：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，37℃培养18～24h，滴加100g/L FeCl3试剂数滴于斜面上，自上流下观察。

结果  须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。

6. 精氨酸、鸟氨酸、精氨酸试验

(1)赖氨酸：赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2。
(2)鸟氨酸：鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用，产生腐胺和CO2。
(3)精氨酸：L-精氨酸经精氨酸脱羧酶的作用，可产生精胺和CO2。

方法
(1)培养基：氨基酸脱羧酶培养基。
(2)操作：待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，35℃培养1～4d。延长时间则常有假阳性出现，假阳性系由蛋白胨中其他种氨基酸分解而造成，故必须同时接种对照管。

结果  检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照(无氨基酸)为黄色。

阳性反应试验管颜色变化过程

紫色→黄色→紫色
原理：
  对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。

7. 精氨酸双水解试验

原理  细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸双水解酶可使精氨酸经过两次水解，产生鸟氨酸、两分子氨和一分子CO2。经气相色谱分析证明，沙门菌分解精氨酸系由于精氨酸双水解酶，而大肠埃希菌则系由于精氨酸脱羧酶。

方法
(1)培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。
(2)操作：自斜面培养物接种，作肠杆菌科的鉴定时可覆盖灭菌的液状石蜡，作假单胞菌属的鉴定时则不能覆盖液状石蜡。于37℃培养。
结果  指示剂颜色转为碱性时为阳性。即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。但由培养基pH的改变不能证明是由精氨酸脱羧酶或由精氨酸双水解酶，欲鉴别应作气相色谱分析。

8. 肉渣消化试验
原理  肉渣消化试验是测定细菌对蛋白质的另一种分解能力。某些梭菌在生长过程中可将肉渣消化。例如肉毒梭菌有很强的消化能力，疱肉培养基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鉴别。
方法
(1)培养基：疱肉培养基。
(2)操作：试验菌按常规法接种于疱肉培养基，用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。于37℃培养数日。
结果  观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。

9. 凝固血清消化试验
原理  某些细菌液化凝固血清，系由于这些细菌产生一种胞外蛋白酶的作用所致
方法
(1)培养基：吕氏血清培养基。
(2)操作：取试验细菌，以无菌方法接种于吕氏血清斜面上，经37℃培养数日，观察结果。  
结果  凝固之血清发生液化为阳性。

(三)有机酸盐和铵盐代谢试验

1. 柠檬酸盐利用试验

原理  有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸钠，使培养基变成碱性。
方法
(1)培养基：柠檬酸盐培养基。
(2)操作：被检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基上，35℃培养l～4d，观察。

结果  培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。
指示剂为：1%溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04%苯酚红 10mL/1000mL水
用脱脂棉过滤，制成后为黄绿色。
斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；
无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-

2. 马尿酸钠水解试验

三氯化铁法
原理：B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀.
方法
培养基:马尿酸钠培养基。
试剂：三氯化铁溶液。
操作：待检菌接种马尿酸钠培养基，35℃培养48h，离心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化铁溶液0.2mL，立即混合均匀，经10～15min观察结果。

结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解为阴性。

茚三酮法
原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，CO2和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚三酮。其中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。
方法：
试剂：l％马尿酸钠水溶液；3.5g茚三酮溶于100mL的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。
操作：0.4ml待检菌与等量的1％马尿酸钠水溶液混合后，35℃培养2h，加入0.2ml茚三酮试剂，振摇后观察。

结果：出现紫色为阳性。

3. 丙二酸盐利用试验

原理  某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。
溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围pH6.0(黄)～7.6(蓝)。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡蓝，溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色。
方法
(1)培养基：丙二酸钠培养基。
(2)操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35℃培养24～48h后观察结果。



结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。

(四)酶类试验

1. 氧化酶试验(Kovacs试验)

原理  氧化酶(又称细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。
方法
(1)试剂：10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液，或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液。
(2)操作：取滤纸片蘸取待测菌落少许，加试剂一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。

结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。

2. 过氧化氢酶试验(触酶试验)

原理  过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。
方法
(1)试剂：新鲜配制的3％过氧化氢水溶液。
(2)操作：挑取1环固体培养基上的待测菌菌落，放于洁净玻片上或试管内，滴加3％过氧化氢数滴，观察结果。实验时必须用18～24h新鲜培养物。陈旧培养物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性结果。

结果  30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者为阴性。

3. 硝酸盐还原试验

原理  某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸反应生成重氮苯磺酸，再与α-萘胺结合，生成红色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。
方法
(1)培养基：硝酸盐培养基。
(2)试剂：①甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；②乙液：α-萘胺0.5g，
5mol/L醋酸100ml。
操作：待测菌株接种到硝酸盐培养基中，35℃18～24h培养后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于试管内，观察结果。

结果出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。

4.过氧化物酶试验

（1）原理:过氧化物酶的作用是将过氧化氢中的氧转移给可被氧化的物质。
（2）其反应如下：试验时，若以联苯胺(4,4-二氨基联苯 )作为被氧化的物质，试验细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢可使苯胺氧化成为蓝色的联苯胺蓝。
（3）方法
试剂：盐酸联苯胺溶液；3％过氧化氢溶液。
操作：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即观察结果。
（4）结果
阳性者于2min内呈现蓝色。



5.脱氢酶试验

（1）原理
细菌的脱氢酶可使相应的作用物脱去氢，但此作用需要一个可还原的化合物作为受氢体。
若用美蓝（亚甲蓝，Methylene blue）作为受氢体的话，细菌如有脱氢酶存在，可使美蓝还原成美白(无色)。但是，美白易被空气中氧气所氧化，故此试验应在隔绝空气下进行。
染料、医药、鉴识血迹
如果用无色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑 ）作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTC可以接受氢而成为红色的Formazan（甲臜zā ) 。后者不再被氧气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。



（2）方法
试剂：1︰30000美蓝水溶液；pH7.4磷酸盐缓冲液；0.1mol／L的作用物水溶液。
操作：①取试验菌肉汤培养物10ml，离心后以缓冲液洗2次，再加缓冲液5ml，制成菌液。②取试管3支，每管加美蓝水溶液0.5ml，于第1管和第3管各加菌液1ml，第2管加缓冲液1ml，置37℃水浴中15min。③第1管和第2管各加作用物2ml，第3管加缓冲液2ml。④各管加无菌液状石蜡0.5ml，使覆盖于液面上。⑤置37℃水浴中，每5min观察一次，记录美蓝变白时间，共观察2h。

(3)结果
若第1管变白即为相应作用物的脱氢酶阳性，不变色为阴性。第2管与第3管为对照管，应不变色。

6. 氧化三苯基四氮唑试验(TTC试验)

(1)原理
部分细菌可还原无色可溶性的氯化三苯基四氮唑，成为红色的三苯甲臜(Formazan)。

(2)方法
(i)试剂
贮存液：用无菌蒸馏水配制Na2HPO4饱和液，取氯化三苯基四氮唑(TTC)775mg，溶于100mlNa2HPO4饱和液中混匀后，放置于暗处，可保存2～3个月。
应用液：取贮存液4ml，加Na2HPO4饱和液至100ml，混匀后，置暗处，可用2～4周。
(ii)操作：①以无菌吸管吸取清洁中段尿2ml置于无菌试管中。②加TTC试剂应用液0.5ml。③混匀后，置37℃,8h培养后观察结果。

(3)结果
出现红色者为阳性，淡红色者为弱阳性，不变色者为阴性。

7. 脂酶试验

(1)原理
某些细菌产生卵磷脂酶，即α-毒素，在有钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性的磷酰胆碱。

(2)方法
培养基：卵黄琼脂培养基。
操作：将待检菌划线接种于卵黄琼脂平皿上，于35℃培养3～6h。

(3)结果
产生卵磷脂酶的细菌，培养3h后，在菌落周围形成乳白色混浊环，6h后扩散至5～6mm。

8. 磷酸酶试验

(1)原理
磷酸酶是一种单膦酸酯的水解酶，可使单磷酸酯水解，其反应可根据反应基质的不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放出酚酞，在碱性环境中可呈红色。

(2)方法
培养基：于1000ml溶化的适宜琼脂培养基并冷至45℃时，加入过滤除菌的1％磷酸酚酞溶液lml，摇匀后倾注平板。
操作：取被检菌的纯培养物接种上述平板，于35℃培养18～24h，于平板盖内加l滴浓氨水，熏蒸片刻。

(3)结果
如有酚酞释出，菌落即变为粉红色

9. DNA酶试验

(1)原理
DNA酶可将脱氧核糖核酸(DNA)长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。
长链DNA可被酸沉淀，水解后产生的寡核苷酸则可溶于酸，在DNA琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围形成透明环。

(2) 方法
培养基：DNA酶试验培养基。
操作：点状接种待检菌于DNA琼脂平皿上，35℃培养18～24h，用l mol/L盐酸倾注平皿，观察结果。

(3)结果
菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性。

10. 血浆凝固酶试验
(1)原理
金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。
凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，可用试管法测出。

(2)方法
(i)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，
分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性。
(ii)试管法：小试管3支内各加入l︰4稀释的新鲜人或兔血浆0.5ml，①其中一支加待检菌18～24h肉汤培养物0.5ml，②另一支加阳性菌株18～24h肉汤培养物0.5ml，③再一支加肉汤培养基0.5ml为阴性对照，轻振混匀。3支试管放37℃水浴中3～4h，观察结果。

(3)结果
待检菌株管和阳性菌株管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阴性。



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