Western Blot操作流程及常见问题分析~不会做western有这一篇就够了，赶快收藏吧！！！

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Western，也称Western blot、Western blotting、Western 印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
一、蛋白提取
组织样蛋白提取方法（需要准备的试剂和仪器：ripa裂解液、PBS溶液、组织样本、匀浆器或研磨仪、离心机、超声仪破碎、冰盒）
1.用灭菌的工具分离新鲜的组织50mg-100mg，并预冷的生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪成可放入2ml离心管的小块。
2.将组织放入匀浆器或研磨仪中，加入适量的含有蛋白酶抑制剂（必要时需加入磷酸酶抑制剂）的ripa裂解液（每20mg中加入150-250ul裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到无肉眼可见的团块，冰浴裂解30min，让组织细胞充分裂解。
3.超声处理10-15s，以完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。（注意为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至合适的频率与功率，将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行水浴超声。超声循环设置如下：超声3s，暂停10s，重复3-5次）。
4.超声处理后将样品置于冰上孵育30min。
5.将上述裂解样品，于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到一个新的EP管，置于冰上备用
细胞样品蛋白提取方法（需要准备的试剂和仪器：ripa裂解液、PBS溶液、细胞样本、超声仪破碎、离心机、冰盒）
1. 对于贴壁细胞：从培养物中吸出培养基，用预冷的 1× PBS 洗涤细胞后，加入含有蛋白酶抑制剂 ( 必要时还要加入
磷酸酶抑制剂 ) 的 RIPA 裂解液 (6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl) 来裂解细胞，然后立即从板上刮下细胞
并将提取物转移至 EP 管，置于冰上。
2. 对于悬浮细胞：将悬浮细胞连同培养基转移到 15ml 离心管，室温 1000rpm 离心 5min，收集细胞沉淀，然后加
入含有蛋白酶抑制剂 ( 必要时还要加入磷酸酶抑制剂 ) 的 RIPA 裂解液 (6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)，
用加样器吸打几次后转入一个新的 EP 管，置于冰上来裂解细胞。
3. 超声处理 10–15s，以完成细胞裂解并剪切 DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率 ( 超声功率不宜过大，并设置超
声间歇，以防止超声探头过度产热 )，将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。
超声循环设置如下：
超声 3s，暂停 10s，重复 3-5 次。
4. 超声处理后将样品继续置于冰上孵育 30min。
5. 将上述裂解后样品，于 4℃，12 000rpm，离心 15-20min，取上清到一个新的 EP 管，置于冰上备用。2、电泳(Electrophoresis)
二、蛋白定量
微孔酶标仪法
1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 稀释标准品：取10μL BSA标准品用PBS稀释至100μL（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL。
准品按 0，1，2，4，8，12，16，20ul 加到 96 孔板的蛋白标准品孔中，加 PBS 补足到 20ul。
3. 将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。
4. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
分光光度计法
有酶标仪，可用分 如没光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。
步骤如下：
1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 稀释标准品：取100μL BSA标准品用PBS稀释至1mL（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/mL。
3. 取八支（或者更多）5mL离心管，标上号，按下表加入试剂。



注意：对于过高的样品浓度，我们建议将样品用 RIPA 裂解液进行合理稀释并充分混匀后，再进行一次浓度测定为宜。
三、电泳上样样品的制备
1. 在上样前，建议用提取样品用的 RIPA 裂解液将制备的组织、细胞蛋白样品的浓度统一调整为相同浓度并充分混匀，
最好都在 3-5µg/µl。
2. 上样量为 20-40µg( 如果是纯蛋白，上样量为 100ng)，根据上样量计算好体积，每管样品分别与 4× 蛋白上样缓
冲液按体积比 3:1 混匀。
3. 煮沸 5-10min，使样品还原变性，然后立即放于冰上备用。
4. 对于剩余的样品，可以统一加入 4× 蛋白上样缓冲液后，将样品在 -20℃或 -80℃保存。
四、1.SDS-PAGE 凝胶的制备
根据要检测的目的蛋白分子量范围，参考下表选择合适的分离胶浓度灌制分离胶，加入保护层 ( 可小心加入 0.5ml 去离子水封压胶面 )。待分离胶凝固后，倒出保护层的去离子水，再灌注浓缩胶。根据样品数量和体积，选择合适的梳子插入浓缩胶。待浓缩胶完全凝固后，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。

分离胶浓度	最佳分离范围
4-12%	40-270kd
4-20%	15-140kd
8%	70-200kd
10%	30-75kd
12%	25-60kd

五、蛋白上样与电泳
将上述变性处理后的样品低速短暂离心后，按照实验设计的上样顺序，分别加入样品孔中。最后，加入合适的预染蛋白 Marker。浓缩胶恒压 80V，分离胶 150V 电压条件下电泳，直至指示剂溴酚兰迁移至凝胶底部。如使用预制胶150v电压跑即可，不需要调整电压。
电泳合格标准：目的蛋白条带位于分离胶的中部，并且条带充分分离。
蛋白转膜 ( 湿转法 )
原理：蛋白因结合 SDS 而带负电荷，在电场中从胶转移至膜上。
1. 将 PVDF 膜在无水甲醇中浸泡 1-3min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5min。胶也可以在转膜液中平衡 3-5min，防止转膜时条带变形，NC 膜不需要甲醇浸泡，需提前转膜液浸泡即可。
2. 制作转膜“三明治”
湿式转膜三明治排列顺序：负极 / 海绵 / 吸水纸 / 胶 / 膜 / 吸水纸 / 海绵 / 正极，全部紧密排列，特别是胶与膜之间不能留有气泡。
三明治安装的方向：负极与胶同侧，向正极方 ( 膜 ) 迁移。
膜的面积：5.2 * 8.4 cm。
滤纸的面积：4 条边均略长于膜的 4 条边。
3. 200-300mA 恒流转膜，转膜时间可参考下表。


六、膜的封闭
封闭的作用：为避免作为检测试剂的特异性一抗与膜发生非特异性结合而造成背景提高，需要对膜上的潜在非特异性结合位点进行封闭处理。
封闭条件：用 TBST 溶解的 5% 的脱脂奶粉或 5% 的 BSA( 建议提前配制，使奶粉或 BSA 充分溶解 )，室温封闭 1h。
另外，需注意膜封闭的一些特殊情况：
● 脱脂奶粉成本低，但不能用于磷酸化蛋白检测。因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，使用
脱脂奶粉时，磷酸化抗体可能也会与奶粉中的磷酸化蛋白结合，从而产生高背景。
● 如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用 BSA 效果更好。
● 某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因也可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，建议参照抗体说明书进行实验。
七、一抗的孵育
1. 用 WB 专用一抗稀释液 ( 对整张膜建议使用 5-10ml)，按一定比例 ( 一般为 1:1000-1:2000) 稀释一抗。
2. 倒掉封闭液，将膜置于适量一抗孵育液中，4℃，水平摇床孵育过夜。
用 TBST 洗膜，3 次，每次 5min。
八、二抗的孵育和洗膜
1. 用 WB 二抗稀释液按一定比例 (HRP 标记二抗稀释 1:5000-1:10 000；荧光二抗 1:10000-1:20000) 稀释二抗。
2. 将膜置于二抗孵育液中，水平摇床室温孵育 1h。
3. 用 TBST 洗膜，3 次，每次 5min。
目的蛋白质显影
● 化学发光法 ( 使用 HRP 偶联的二抗 )
1. 制备 ECL 工作液：A 液和 B 液等体积的混合，例如 0.5ml A 液和 0.5ml B 液混合，混匀后即可使用。
2. 用量以充分覆盖印迹膜为准，每 10cm2 膜需要大约 1 ml 工作液。
3. 将印迹膜有蛋白的一面朝上平整的铺在一张平板上，加上配好的发光底物工作液。
4. 将工作液均匀滴加在印迹膜上，孵育 1-5 min。可将一洁净的保鲜膜或透明的玻璃纸平整的铺在孵育有工作液的印
迹膜上，轻轻赶出其间的气泡。
5. 用合适的照相器材直接记录蛋白膜的化学发光图或使用 X 射线胶片曝光 ( 曝光 5 秒至 1 分钟，通过调整 X 片的曝
光时间获得最佳结果 )。
● 荧光底物法 ( 使用荧光二抗 )
1. 将膜上多余的 TBST 沥干，可使其干燥。
2. 使用合适的荧光扫描仪 ( 如 LI-COR Odyssey 荧光成像系统 )，根据制造商的建议扫描膜上条带。
四、常见问题和解决方案





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