荧光显微镜

千姿百态

介绍

荧光是普遍存在的发光家族中的一种，在该家族中，易受影响的分子通过物理（例如，吸收光）、机械（摩擦）或化学机制从电子激发态发光。通过紫外线或可见光光子激发分子而产生光致发光的现象称为光致发光，根据激发态的电子结构和发射途径，光致发光正式分为 荧光和磷光两类。荧光是某些原子和分子吸收特定波长的光，然后在短暂的时间间隔（称为荧光寿命）后发射更长波长的光的特性。磷光过程的发生方式与荧光类似，但激发态寿命要长得多。


荧光过程由三个重要事件控制，所有这些事件都发生在相隔几个数量级的时间尺度上（见图 1(a)）。入射光子激发敏感分子的过程发生在飞秒（10^15秒）内，而激发态电子振动弛豫到最低能级的过程则要慢得多，可以用皮秒（10^12秒）来测量。最后的过程，即发射波长较长的光子并让分子返回基态，发生在相对较长的纳秒（10^9秒）时间内。尽管从激发到发射的整个分子荧光寿命仅以十亿分之一秒来测量，但这一现象是光与物质相互作用的惊人表现，为稳态和时间分辨荧光光谱和显微镜等广阔领域奠定了基础。由于荧光研究具有极其灵敏的发射特征、空间分辨率和高度特异性，该技术已成为遗传学和细胞生物学中的重要工具（图  1（b）中的卡通）。
十七、十八世纪，有几位研究人员报告了发光现象，但英国科学家乔治·斯托克斯爵士于 1852 年首次描述了荧光，并创造了该术语以纪念蓝白色荧光矿物萤石（氟石）。斯托克斯还发现了以他的名字命名的发射光谱中波长向更长的偏移（称为斯托克斯偏移；图  1(c) 和图  2）。荧光最早是在二十世纪早期由几位著名科学家在光学显微镜中发现的，其中包括奥古斯特·科勒和卡尔·赖歇特，他们最初报告说荧光在紫外显微镜中是一种麻烦。第一台荧光显微镜是由德国物理学家奥托·海姆施泰特和海因里希·莱曼在  1911 年至 1913  年间开发的，是紫外仪器的衍生产品。这些显微镜用于观察细菌、动物和植物组织中的自发荧光。此后不久，斯坦尼斯拉夫·冯·普罗瓦泽克  (Stanislav Von Provazek) 使用荧光显微镜研究固定组织和活细胞中的染料结合，开创了一个新时代。然而，直到 20 世纪 40  年代初，阿尔伯特·库恩斯 (Albert Coons) 才开发出一种用荧光染料标记抗体的技术，从而催生了免疫荧光领域。到 21  世纪初，荧光显微镜领域引发了细胞生物学的一场革命，将活细胞成像的能力与使用合成和遗传编码的荧光探针对单个细胞器和大分子复合物进行高度特异性的多重标记相结合。


与基于宏观样本特征（例如相位梯度、光吸收和双折射）的其他光学显微镜模式相比，荧光显微镜能够仅基于荧光发射特性对单个分子物种的分布进行成像。因此，使用荧光显微镜可以监测用特定荧光团标记的细胞内成分的精确位置，以及它们相关的扩散系数、传输特性和与其他生物分子的相互作用。此外，荧光对局部环境变量的剧烈响应使得人们能够研究活细胞和组织中的  pH 值、粘度、折射率、离子浓度、膜电位和溶剂极性。
荧光显微镜滤光片配置

任何荧光显微镜的基本特征都是提供一种机制，通过选择性过滤的照明激发样本，然后使用第二个滤光片隔离较弱的荧光发射，从而能够在暗背景下以最大灵敏度形成图像。在许多实验中，生物样本中的局部探针浓度非常低，以至于只有一小部分激发光被荧光物质吸收。此外，在那些能够吸收一定量照明的荧光团中，发射二次荧光的百分比甚至更低。由此产生的荧光发射亮度水平将比照明亮度低三到六个数量级。因此，荧光显微镜的基本问题是产生高效的样本照明，同时捕获与强度大得多的照明带有效分离的弱荧光发射。在现代荧光仪器中，这些条件通过滤光片组合来满足，这些滤光片根据二色分束器的作用和特性协调激发和发射要求。


荧光分子只能吸收有限波长范围内的光，该范围由离域电子的性质和范围决定，大约从 20 到 100 纳米（如图 2 中的黄色光谱所示）。在描述荧光分子时，术语荧光染料是指表现出荧光的分子，而荧光团用于识别附着到结合伙伴上的荧光染料，使其能够靶向特定的生物实体。描述和比较荧光团时常用的三个基本参数是摩尔消光系数、量子产率和荧光寿命。摩尔消光系数广泛应用于光谱、显微镜和荧光领域，用于将各种化学物质的吸光度单位转换为摩尔浓度单位。消光系数是通过测量在具有一厘米路径长度的比色皿中一摩尔浓度（每升一摩尔）目标化学物质在参考波长（吸收分子的特征）下的吸光度来确定的。参考波长通常是光谱中紫外线或可见光部分的最大吸收波长。各种荧光染料或荧光团都表现出自己特定的吸收和发射光谱（图  2），这取决于荧光分子的内部结构，有时也取决于其周围环境。此外，并非每个光子都能被有效吸收并重新发射为更长波长的辐射（光谱颜色与感知颜色列于表  1 中）。发射的光子数与吸收光子的百分比对于每个荧光团来说都是一个常数，称为量子产率。最后，荧光团在激发态下不发射光子的时间称为荧光寿命。


一般来说，滤光片可根据描述滤光片作用和波长传输或吸收曲线时使用的术语进行分类。有两种基本类型的滤光片可调节特定波长的传输。带通滤光片（图  3）可传输一段波长并阻挡指定传输范围以上和以下的所有光。这些滤光片的光学性能由其中心波长 (CWL) 和带宽（也称为最大传输一半的全宽  (FWHM)）来表征。边缘滤光片通常也被称为长通滤光片和短通滤光片，并根据其在峰值传输的 50% 处的截止波长或截止波长进行分类（见图  3）。长通滤光片可传输长波长并阻挡短波长，而短通滤光片则具有相反的特性，即通过或传输短波长而阻挡其他波长。通常，边缘滤光片具有非常陡峭的斜率，其平均传输值是根据过渡区域（传输域和阻挡域之间的边界）中光的传输和阻挡效率计算得出的，而不是根据滤光片通过或传输的整个波长范围计算得出的。
荧光显微镜的关键是使用适当的滤光片将强烈的激发光与荧光团产生的较弱的二次发射光隔离开来。荧光过滤中的标志性光学元件是双色镜，其设计为与来自光源的入射光以及显微镜光轴呈 45 度角，与物镜和样本共线。来自光源（如下所述）的光穿过落射照明光学系统，直到到达荧光滤光立方体（见图 2(b)），在那里它穿过定义的带通激发滤光片，然后被双色镜反射到物镜中，聚焦在样本平面上。这种选择性过滤的光用于激发荧光团，荧光团的光谱特性使其能够吸收激发滤光片带通允许的区域内的光。荧光发射（这种光是非相干的，发射到荧光团周围的球形体积上）被物镜捕获并通过二色镜反射回来，二色镜又将大部分污染激发光反射回光源。穿过二色镜的发射波长在进入目镜或相机图像平面之前，会通过另一个定义带通的滤光片（发射滤光片）进一步净化。
图  4 显示了荧光滤光片立方体（或块）的剖面图以及组件滤光片的光谱透射曲线图，这是用于将激发照明与荧光发射分开的典型滤光片组合。激发滤光片光谱（图  4(a)；红色曲线）在 460 至 500 纳米之间表现出高水平的透射率（约  80%），用于激发绿色荧光蛋白或荧光素等荧光团。对角放置的双色镜（图  4(a)；黄色曲线）反射激发光谱区域中的波长，同时以相对较高的效率传递较高和较低的波长。双色镜的透射曲线在 450 至 510  纳米之间明显下降，这代表反射率达到峰值，用于将此光谱区域中的波长以 90  度角从激发滤光片引导到样本上。滤光片块中的最后一个组件是发射或屏障滤光片（图 4(a)；白色曲线），它是另一个带通滤光片，可传输 515 至  565  纳米范围内的波长，这对应于绿色可见光。各种叠加光谱的透射和反射波长带之间的边界设计得尽可能陡峭，以确保反射和透射波长几乎完全分离。这种滤光片组合的性能非常出色，可在黑色背景上产生清晰明亮的图像。


由于双色镜仅反射窄带宽的光，因此设法穿过激发滤光片的短于  445 纳米和长于 515 纳米的照明波长也会穿过双色镜。请注意，激发光的反射效率并非  100%，因此少量蓝青色光会不经反射而穿过双色镜。此外，并非所有波长高于 510 纳米或低于 450  纳米的光都会穿过镜子。这些光中的一小部分会通过镜子反射，穿过物镜到达样本上。从激发滤光片穿过双色镜的光部分被滤光片块内部的平面黑色涂层吸收，但部分光会从表面反射并以斜角穿过屏障滤光片，从而产生背景噪声。
样本发出的荧光（本例中主要是绿色波长）是由蓝青色光激发产生的，被物镜收集并穿过二色镜和屏障滤光片。屏障滤光片经过专门设计，只允许波长在  515 至 565  纳米之间的光到达显微镜目镜和/或探测器。在执行此任务时，屏障滤光片有效地阻止样本反射的激发光波长到达探测器。但是，从样本返回的大部分激发波长被二色镜反射到激发滤光片和照明器。图  4(b)  中所示的滤光片配置的净效应是将强度高得多的激发光与弱得多的荧光发射分开，如上所述。要记住的最重要的一点是，荧光显微镜中涉及的滤光片的截止水平不是绝对的，而是允许一些波长范围之外的光透过。多波段滤光片组合包含双色镜的专门版本，称为多色镜，它可以使用多个带通激发和发射滤光片来同时对两种或多种荧光物质进行成像。
荧光显微镜光源

选择荧光显微镜光源时，主要考虑因素是光谱分布与被研究荧光团的量子产率和吸收率的关系。此外，光源必须与用于捕获图像的检测器的灵敏度兼容，无论是人眼、传统胶片、光电倍增管、增强型视频管还是数码摄像系统。选择还取决于照明模式。电弧放电或发光二极管 (LED)   光源可满足宽视野荧光显微镜要求，而共焦、全内反射和多光子显微镜则需要适配各种激光系统。选择荧光光源时，重要的是要记住大多数荧光团是由紫外线、蓝光和绿光波长激发的。最流行的光源电弧放电灯（图  5(a) 至 5(c)）的光输出比通常用于透射光照明的 12 伏石英卤素灯亮 10 到 100  倍。宽视野荧光显微镜最常用的照明光源是汞弧灯（图 5(a)），它通常常规包含在基本型号的显微镜配置中。当定量分析至关重要时，可以使用氙弧灯（图  5(b)），而通过液体光导耦合到显微镜的金属卤化物（图 5(c)）光源已经变得非常流行。三种主要的弧灯设计中的任何一种都适用于 90%  以上的荧光研究。LED 照明（图 5(d)）源也正在成为弧灯的可行且稳定的替代品。图 5 显示了最广泛使用的荧光光源的光谱输出曲线。


在荧光显微镜中，正确对准弧光灯对于实现柯勒照明和避免荧光图像中出现亮区和暗区至关重要。灯箱的质量通常可以通过正确对准的稳定性和调节旋钮保持对准的效率来判断。灯座应配备灯定心螺钉，以便将弧光图像对准物镜后孔的中心，灯箱应包含红外滤光片，以阻挡产生大量热量的远红和红外中的超长波长。几种灯箱设计都内置了近红外抑制滤光片或包含用于这种滤光片的插槽，以消除在某些应用中通过视野看到的微红色背景。最重要的是，灯箱本身不应泄漏有害的紫外线波长，最好包含一个开关，如果在操作过程中不小心打开了外壳，则该开关会自动关闭灯。灯箱还应足够坚固，以承受可能的燃烧器爆炸。
荧光显微镜应用种类繁多，通常需要一系列光源和波长来满足特定荧光团和成像条件的需求。在某些情况下，可能需要结合超灵敏相机系统使用极低的辐射，而对于其他研究，可能需要强激光激发以杀死活细胞或选择性漂白荧光团。波长要求通常涵盖整个可见光谱区域以及部分紫外线和红外线。由于单个光源无法满足这些多重照明要求，制造商现在提供适配器，使两个或更多个灯能够同时连接到单个显微镜上。
荧光显微镜配置

现代荧光显微镜的核心是反射光垂直照明器，它夹在观察观察管和载有物镜的物镜转换器之间，如图  6  所示。照明器旨在将高强度光源（如电弧放电灯）产生的光引导到标本上，首先将光通过显微镜物镜聚焦在横向标本焦平面上，然后使用同一物镜捕捉标本发出的光。这种照明策略有几个优点。显微镜物镜首先充当经过良好校正的聚光镜，然后收集成像荧光发射以传输到目镜或相机检测系统。因此，物镜始终处于正确对准状态。此外，标本散射或反射的大部分激发光（超过  360  度角）会远离物镜前透镜元件，而不是像透射荧光照明那样直接投射到玻璃中。最后，被照亮的标本区域被限制在被观察的同一区域内，并且照明和光收集都可以利用物镜的全部数值孔径。


落射荧光照明器与典型的反射光照明器之间的主要区别在于荧光中省去了扩散滤光片，因为扩散滤光片会不必要地降低激发强度。然而，在反射光显微镜中，使用钨卤素光源时需要扩散滤光片才能实现均匀照明。此外，现代荧光显微镜照明器通常包含一个转盘或滑块，可容纳多达  6 或 8  个滤光块以实现多色成像。在荧光中，红色衰减滤光片通常插入垂直照明器的插槽中，用于消除有时会干扰的红光和近红外光部分，防止它们到达样本。现在，多色荧光越来越多地用于检查标有两个或更多荧光团的样本。这种方法可以用不同的颜色突出显示不同的结构，可以一起或单独查看。多种颜色使显微镜学家能够在荧光照明下观察相互作用的物种。
荧光显微镜成功的关键

通过采取一些预防措施，新手显微镜专家可以确保大多数荧光显微镜研究都能取得成功。荧光中最重要的方面可能是确保滤光片组传输激发和发射所需的波长，同时尽可能完全地阻挡带外光。在实践中，这通常非常困难，因为激发光通常至少比发射光亮一百万倍。回顾一下，必须阻挡所有激发光到达目镜和相机探测器，同时必须捕获尽可能多的发射光并将其引导至成像传感器。
荧光显微镜中的光源必须经过精心选择，以在所需的光谱范围内提供大量激发能量（通常为每带宽  10 到 100  纳米）。在许多情况下，可以成功使用线发射弧光放电灯，尤其是当标本用荧光团标记时，荧光团的吸收峰与光源的光谱线相对应。例如，Alexa  Fluors 405 和 546 是合成荧光团，与汞弧光灯产生的 405 和 546  纳米线重叠。将这些染料与汞灯一起使用将确保非常明亮的发射，相对容易观察和记录。售后染料制造商现在提供多种针对特定弧光放电和激光线进行调节的荧光团。当需要选择在汞灯或氙灯的低功率连续区域内激发的荧光团（例如  Alexa Fluor 488 或增强型绿色荧光蛋白）时，显微镜技术人员应考虑改用 LED 或金属卤化物灯，它们在这些区域具有更高的功率输出。


荧光显微镜所用的物镜由许多透镜元件（有时多达  16  个或更多）制成，这些透镜元件会降低穿过物镜的荧光发射亮度，这是由于物镜内玻璃-空气界面的反射。尽管如此，制造商仍提供许多专门设计用于荧光照明的物镜（见图   7），因此在光谱的紫外线和可见光部分都具有高透光率。事实上，最现代的物镜经过微调，可以在较大的波长范围内实现共焦成像，如果经济条件允许，应考虑这些物镜。在使用荧光显微镜进行活细胞成像时，应尽可能使用包含校正颜色以补偿盖玻片和温度变化的水浸物镜。固定和染色的标本，尤其是那些用明亮的荧光团标记良好的标本，可以用高数值孔径油浸物镜轻松成像。务必记住检查物镜和浸没液的自发荧光（通过检查未嵌入标本的安装盖玻片），这将掩盖标本细节并导致更高的背景。
进行荧光显微镜研究时需要考虑的最重要的一点是样本产生的荧光发射水平非常低，如上所述。物镜负责收集尽可能多的这种发射，因此使用最大数值孔径的物镜可以获得最佳结果。回顾一下，如果物镜的数值孔径小于  0.5，到达检测器的发射光量会很低，而如果物镜的数值孔径加倍，则可以收集大约 16  倍的荧光发射。浸没介质，特别是油，有助于消除光从玻璃表面反射产生的光损失，从而呈现更明亮的图像。图 8  显示了显微镜物镜数值孔径光锥的比较，以展示收集光量的巨大差异。


成功进行荧光显微镜检查的最实用提示包括确保在室内照明较弱的环境中进行成像（通常关闭灯光）。将手电筒放在显微镜附近通常很方便，以便于在黑暗的房间中记录数据、做笔记或配置显微镜。当室内灯亮着时，大量的顶灯会进入物镜并在图像中产生噪音。此外，当不观察或成像标本时，应使用快门或滤光片阻挡激发光，以避免照明系统不必要的光漂白。如果浸没介质是自发荧光的，背景会明显变亮，图像对比度会降低。在使用新的浸没油对标本进行成像之前，务必检查其状态。另一个要点是切勿移除集成的防热滤光片，因为荧光滤光片对照明器发出的热量和强光很敏感。还应定期检查照明器，并在必要时重新调整。安装新灯时，这一点尤其重要。最后要考虑的一点是标本准备。染色后务必彻底清洗标本（组织和细胞），以去除只会增加背景噪音的残留荧光团。
当与光学显微镜结合使用时，荧光使研究人员能够研究细胞生物学中的各种现象。最重要的是分析亚细胞组合体（如细胞核、膜、细胞骨架丝、线粒体、高尔基体和内质网）中特定大分子的细胞内分布。除了对细胞解剖结构进行稳定状态观察外，荧光还可用于在时间分辨测量中探测细胞内动力学和各种大分子之间的相互作用（包括扩散、结合常数、酶反应速率和各种反应机制）。同样，重要的细胞功能（如胞吞作用、胞吐作用、信号转导和跨膜电位产生）也已通过荧光显微镜进行研究。由于荧光研究具有极其灵敏的发射谱、空间分辨率和高特异性，该技术正迅速成为遗传学和细胞生物学的重要工具，并处于生物医学研究的前沿。

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