亲和层析法纯化抗体技术指南来了！

检验之星

在无数应用中，抗体仍然是非常有用的，包括基础研究、成像、靶向传送、色谱、诊断和治疗。在生产阶段,抗体一般都存在于复杂的细胞中，而且它们的大部分应用都需要纯化后使用。在多种不同的技术中，亲和层析是纯化抗体最具选择性、快速和容易的纯化方法。
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亲和层析的原理是什么？
亲和层析是液相层析方法中选择性和通用性最好的技术，依赖于蛋白及其配体的可逆性定点结合，如激素与其受体，酶与其底物，抗体与抗原等。可以利用这种特异性的相互作用，将相互作用物质中的一相，被称为亲和配基，固定到柱子上作为固定相来进行亲和层析。通过亲和配基的选择性吸附，目的蛋白从复杂组分中洗脱出来。洗脱完毕后，层析柱再生，用于下一个样品。

亲和层析是最常用的生物物质分离方法之一，具有特异性高，速度快，操作简便的特点。成熟的技术模型包括抗体或者抗体片段、His标签蛋白、GST标签蛋白、蛋白酶、凝血因子等的分离纯化。



亲和层析组成有哪些？
亲和层析可以选择多种不同类型的结合剂（配基）和固相支持物（基质），通过优化不同的属性，如特异性，选择性，可重复性，交联化学，成本有效性等，亲和层析可以用来大规模地纯化抗体，获得想要的产率和纯度。多年以来，不断努力发现和制造高质量的介质和配基，辅以优化有效的亲和层析方法，来达到以经济有效方法产生越来越多高纯度的目标抗体。

表1  用于亲和层析的不同基质
类型
示例
商业名称
天然
琼脂糖
琼脂糖
葡聚糖
葡聚糖
纤维素珠
纤维素珠
化学合成
丙烯酰胺
生物凝胶
聚苯乙烯
聚苯乙烯
聚甲基丙烯酸甲酯
分离HEMA
无机
多孔二氧化硅
多孔二氧化硅
玻璃纤维
玻璃纤维
二氧化钛
二氧化钛

实验材料
⒈实验仪器：蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。

⒉实验试剂
TBS缓冲溶液：6.06gTris(50mM),8.78gNaCl(150mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH7.4。
中和缓冲溶液：121.2gTris(1M),87.8gNaCl(1.5M),0.37gEDTA(1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0。
洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH2.7。

实验方法
⒈准备蛋白AsepharoseCL-4B亲和柱
通常准备5ml或10ml蛋白AsepharoseCL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将蛋白AsepharoseCL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1ml/分-2ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。


⒉制备抗血清
将抗血清放入冰水或4°C冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37°C预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C，15,000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。

⒊亲和层析
将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5mlEP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2°C~8°C保存。
用含0.05%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2°C~8°C环境。

【实验结果】
利用SDS/PAGE检查洗脱获得的蛋白纯度并利用免疫电泳技术检查纯化后抗体的滴度。

【注意事项】
⒈叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作
⒉ 在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。

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