抗体亲和力低会导致非特异性增加吗？

莺歌燕舞

做出了几株抗体，用来制备二抗，就是在抗体上偶联了HRP，然后用来作为我elisa的二抗，我做的是双抗夹心elisa，就是包被抗体，然后加抗原，然后再加二抗，可是在做elisa的时候发现非特性很高，阴性的OD也有2（但是空白对照只有0.1），我的阴性是包板的时候不包一抗改为pbs。
想问为什么非特异性会那么高，是跟抗体的亲和力有关吗？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/298709110

队长是我

免疫分析中的干扰会导致常规检测的假阳性和假阴性结果产生 。各种干扰频发的原因有：
• 人口老龄化
• 越来越多的患者患有：
• 慢性自身免疫性疾病
• 过敏性疾病
• 现有分析手段的检测水平限制
• 夹心法应用增多
干扰根据其生化原因及对分析性能的影响，可分为以下几类：
1. 病人样本中抗体引起的干扰

如：来自病人样本的HAMA (人抗鼠抗体)、HAAA (人抗动物抗体)、嗜异性抗体、类风湿因子。
2. 样本内源性成分引起的干扰

如：白蛋白、补体、溶菌酶、纤维蛋白原、α-1抗胰蛋白酶、非典型高脂、高盐、高糖、高粘度。
3. 检测试剂引起的干扰

检测试剂组分，如荧光或酶标记，可以与样本中的物质发生交叉反应或改变检测抗体的结合特性。



Fig. A: 正 常 夹 心 法 检 测 ， 无 干 扰 → 正确结果 Fig. B:干扰抗体桥联捕获抗体和检测抗体 → 假 阳 性 结 果 Fig. C: 干 扰 抗 体 结 合 捕 获 抗 体 → 假阴性结果Fig. D: Assay Defender®阻止干扰抗体的结合 → 正确结果

Assay Defender® 可有效消除各种干扰，防止假阳性或假阴性结果的产生。
Assay Defender® 为总HAMA/干扰阻断剂，即用型分析缓冲液，用于减少因HAMA（人抗鼠抗体）、类风湿因子、非特异性结合、交叉反应、基质效应等造成的实验干扰。可用于使用捕获抗体/包被抗体的免疫分析。尤其适用于含有HAMA（人抗鼠抗体）或其他AAA（抗动物抗体）的人或动物样本。
Assay Defender®使用方法

Assay Defender®是一款即用型稀释缓冲液，适用于人或动物体液样本。使用简单，直接用 Assay Defender®替代之前的稀释液即可。校正品也需用Assay Defender®稀释。样本稀释比按照1：2或者更高。大多数应用中适宜的稀释比为1:10（1份样本+9份Assay Defender®）。



Assay Defender® 可高效地防止干扰样本中的假阳性结果

使用ELISA方法，检测来自类风湿性疾病患者（样本1和2）的血清样本中肝癌细胞生物标记物hAxl的表达情况。样本3 是来自健康人的无干扰血清样本。样本分别用单独PBS-T/BSA、PBS-T/BSA +HAMA Blocker 1/HAMA Blocker 2 / HAMA  Blocker 3、CANDOR的Assay Defender®进行稀释。单 独 使 用 Assay Defender® 即可完全消除干扰，因此对这两组干 扰样本给出正确的阴性结果 (< 25 ng/mL) 。 无 干 扰 的 样 本 结 果 不 受 Assay Defender®影响。


Assay Defender®使用方法示例

当分析物与抗体结合，可能会存在干扰效应的高风险，此时使用Assay Defender® 显得尤为重要。
ELISA

Assay Defender® 替代常规样本稀释液。样本可用 Assay Defender®按照至少 1:2, 或 可 能 1:10 (1 份样本 + 9 份 Assay Defender ®比例进行稀释)。


如果分析物浓度足够高，则更高的稀释比例也不是问题。
Assay Defender®也适用于免疫PCR和蛋白质芯片作为样品稀释液。

Lateral Flow Assay侧向层析

Assay Defender® 可替代流动缓冲液或淋洗液。



微珠检测平台（含样本稀释）

Assay Defender®替代常规样本稀释液。稀释比例取决于分析物浓度情况。



微珠检测平台（不含样本稀释）

Assay Defender® 替代捕获和检测微珠的保存液。

队长是我

谢邀！

阴性高不会是抗体亲和力低引起的吧！
1、一抗包一下试试。
2、换个封闭液试试看。
3、洗板洗干净。
4、你的酶标抗体与一抗有反应？