Adv. Photon. | 新型傅里叶光学层析显微成像技术在肌肉组织中的应用

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Advanced Photonics 2024年第2期文章：


研究背景
定量相位成像（Quantitative phase imaging, QPI），通过引入相位延迟检测半透明细胞和组织，能够提供透明生物样本的定量信息，并且具有低的光毒性，因此已成为科学和临床研究中不可或缺的工具，可用于包括监测神经元放电和癌细胞系检测等领域。除了标量相位对比之外，透明样本还表现出各向异性，如材料双折射等重要的内在光学对比机制。利用偏振敏感显微镜还可以定量监测脂质膜中分子排列的方向，用以研究多器官间的相互作用活动。
目前，人们对于从样品中测量偏振敏感的量化相位成像（polarization-sensitive quantitative phase imaging, PS-QPI）方法可以分为两类：一种是依靠干涉检测，另一种是利用计算相位恢复方法。干涉方法（例如离轴全息）只需进行一次测量就可以产生偏振敏感相位图像，并且可以通过衍射层析成像方法拓展到3D图像。但是这些方法通常需要复杂的相干激光照射和精密的系统对准，这为临床应用添加了额外的设计要求。另一方面，计算相位恢复方法依赖于图像重构算法，该算法可将多个强度测量转换为相位敏感信息输出，并且成本较低。
计算偏振显微镜因其简单的仪器设计，越来越多的被应用于生物样品的成像，例如，用于研究大脑切片内的白质纤维束，血液涂片诊断疟疾以及从尿液样本中识别磷酸钙晶体。而且这些方法已扩展至对三维样本（如经轴向扫描的轴突和心脏组织）的成像。创建这些样本的高分辨率偏振特性对研究生物学和病理学至关重要。尽管过去科学家已经开发了许多技术，诸如基于共聚焦方法在内的层析成像技术来对肌肉组织和神经类器官等进行成像，但仍缺乏能够在高分辨率下同时捕捉大范围三维空间中量化相位和各向异性的显微技术。最近的一项研究试图利用非轴向LED来创建三维各向异性图像，但并未提供层析介电常数矩阵重构。
近期，美国杜克大学的Roarke Horstmeyer教授研究团队报道了一种非标记三维傅里叶光学层析显微成像技术（Tensorial tomographic Fourier Ptychography, T2oFu），可同时对三维空间中的量化相位和各向异性样品信息进行成像。T2oFu建立在傅立叶叠层成像技术的基础上，这是一种量化相位成像技术，还突出了光的矢量特性。该成像系统由LED矩阵、偏振发生器以及偏振敏感相机的标准显微镜组成。通过在三维空间中对各向异性样品的偏振强度进行测量，可以计算出其介电张量。团队通过对肌肉纤维和病变心脏组织的折射率，双折射率和取向等进行三维重建来展示T2oFu的性能。对健康肌肉纤维的重建揭示了其具有一致取向的三维细丝结构。此外，团队还展示了对含有用于检测心脏淀粉样变性的重要偏振信息的心脏组织样本的重建。相关成果以“Tensorial tomographic Fourier Ptychography with applications to muscle tissue imaging”为题，发表在Advanced Photonics 2024年第2期。
研究内容
T2oFu成像系统如图1A所示，照明包括一个25*25的LED阵列和左圆偏振片。LED阵列波长521 nm的圆偏振光，从不同的角度照射3D样品。使用微型控制器和电压电平转换器依次点亮每个LED像素。光学系统由一个无限远校正物镜(0.25 NA或0.4 NA)和一个管镜组成。选择最大数值孔径来匹配物镜的数值孔径。偏振敏感性CMOS相机用于强度图像拍摄。偏振相机通过在像素阵列和微透镜阵列之间放置2*2线偏振器（图1A虚线框）对四种不同偏振方向（0°、45°、90°和135°）的光进行分析。图1B方框中展示了从不同角度照射时的典型强度图像。通过求解相应的逆问题将这些强度测量值融合起来，形成三维样品介电张量重构，如图1C。



图1 方案流程图

肌肉纤维成像
肌肉骨骼纤维中固有信号的高对比度和高分辨率结构成像对于快速检测可能导致骨骼肌病变的肌原纤维结构变化至关重要。目前，通常使用复杂且昂贵的系统，如二次谐波生成（second harmonic generation, SHG）显微镜来对3D肌肉组织成像。SHG利用像肌球蛋白等分子的非线性光学特性的偏振特性差异，采用高功率、超短脉冲激光的点扫描配置来实现。该研究团队在此展示了基于LED的非扫描廉价系统对单个健康肌肉纤维进行3D  T2oFu重建结果，与文献中描述的SHG成像结果相似。图2A展示了用中心LED捕捉到的肌肉纤维图像。图 2B展示了肌肉纤维的三维重建图像。图2C展示了同一肌纤维从不同视角拍摄的图像，其中在肌纤维下方放置了一根90°弯曲的非肌肉纤维。图2D展示了在不同深度处重建的肌纤维的取向和双折射现象，显示出健康肌纤维的规律性图案。重建图像显示非肌肉纤维（D1）在弯曲处发生了方向上的变化，而肌肉纤维的方向保持不变。此外，重建图像的分辨率足以清楚地分辨肌肉纤维（D3）。图2E展示了图2D重建的方位直方图，显示了两种不同的细胞类型。



图2 肌肉纤维的图像重建

心脏淀粉样变性成像
心脏淀粉样变性是一种致命疾病，仅在美国就有超过1.2万名患者，10年生存率不足5%。在目前的实践中，所取的组织首先被冷冻并切成薄片，然后用一种深红色的染料染色，并通过偏振显微镜进行观察。图3A展示了心脏淀粉样变性的心脏组织样本的亮场图像。图3B为用交叉偏振彩色显微镜成像的同一区域。鲜艳的苹果绿色表明样本组织中很可能已经形成了淀粉样蛋白。图3C、D为重构后的折射率和双折射率，框选区域的放大图则如图3E-H所示。图3E、G分别展示了不同深度的侧向切面，而图3F、H分别展示了用图3C、D虚线标出的区域的横截面。但由于样品切片很薄，研究人员无法观察到不同层之间明显的结构变化。然而，双折射重建的结构与彩色交叉极化图像相关联，未来可能有助于现场快速检测。



图3 心脏淀粉样变性的心脏组织样本图像

结论与展望
研究团队提出了一种新型的非扫描显微镜技术T2oFu。基于计算照明策略可同时对三维空间中的量化相位和各向异性样品信息进行成像，并且能够很好地重建厚的生物组织样本图像。为了后续临床转化的成功，提高T2oFu的帧率，需要配置高闪烁频率的LED。新型高灵敏度摄像头传感器也将在保持良好的信噪比方面发挥重要作用。此外，还可以采用数据驱动的重构方法进一步加速图像重构。

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