做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！

空白派

荧光定量PCR（qPCR）是目前病原检测领域使用最为广泛的核酸检测方法（PCR检测技术概述）。尤其是非洲猪瘟和新冠发生后，qPCR检测得到了极大的普及，对于刚刚进入qPCR检测领域的人，很容易钻入了“唯Ct值”的牛角尖，今天我们就聊聊qPCR中的Ct值。
一、Ct值的基本概念
   1、什么是Ct值
   阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值。
    模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。
    Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。



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    2、与Ct值有关的参数
    标准曲线Standard curve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
    相关系数Correlation coefficient (R^2) ：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。
    扩增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。




斜率Slope ：当扩增效率为100%时斜率为-3.32，当90%-110%时的斜率为-3.58 ~ -3.10。






3、Ct值与模板拷贝数的关系
    理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。
    由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前最常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。
    用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。
二、关于qPCR中Ct值的几点思考
   1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数？
    通过制作标准曲线（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以获得未知样品的初始模板拷贝数，前提是需要样品与标准品同时扩增，定量标准品需要使用标准物质等定量准确的物质（OD260/280换算的的拷贝数误差很大），即使如此定值结果仍存在一定的误差。
    2.荧光定量PCR是否为定量方法？
    虽然名字里有“定量”，但是qPCR的间接定量方式又复杂，又受很多因素影响，又不准确，在计量领域是不被认可的。目前的核酸检测方法中只有数字PCR是真正的定量检测方法，其余的都是定性检测方法。
    3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标？
    qPCR试剂的评价需要从分析敏感性（最低检测限），分析特异性（交叉反应），重复性（精密度），诊断敏感性，诊断特异性等多个指标去衡量 （诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正），诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？）。仅凭Ct值的高低去判断一个qPCR试剂盒的优劣太片面，不同试剂盒的Ct值不具有可比性。有些试剂盒采取先进行几个循环的预扩增，再进行正式循环的做法就是为了使Ct值看起来更低。
     4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？
这里指的是大部分的qPCR试剂盒的循环数为40个或45个，我们能否在不改变试剂盒的设计的前提下，仅通过将40个循环增加到45个循环，或是将临界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式来提高试剂盒的敏感性呢？
   4.1 从原理上解释
    理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达最大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围为Ct:15-35。通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的循环数可能会达到38或更高，如下图我用qPCR和数字PCR测到了1拷贝模板对应的Ct值为37.91。当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的循环数的Ct值可能会更高。


当初始模板核酸浓度≤1 copies/μL时，这时的影响因素不光是你能否检测到，还取决于你每次能取到模板的概率。因为在低浓度下，每次取到模板的概率是服从泊松分布的。不明白的可以看看（诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？）
（At very low copy numbers，under 20 copies per tube ，the random variation due to sampling error（poisson's error law）become significant .--《MIQE&qPCR》4ed）
     4.2 qPCR循环数试验
    模板浓度：将标准物质稀释为0.5，1，2，3，4，5 copies/μL，模板上样量2 μL，每个浓度10次重复。
    扩增体系：使用相同的引物探针和扩增体系进行扩增，扩增体系体积为20 μL。该扩增体系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。
    循环数：分别进行40个循环和45个循环，其他条件完全一致。




试验结果：
    （1）最低检测限：40个循环和45个循环的最低检测限均为3 copies/μL ；
    （2）低浓度模板的阳性检出率：2，1，0.5 copies/μL的阳性检出率完全相同，分别为90%，70%，60%；
    （3）平均值，SD，CV：将两者平均值做配对T检验的P值为0.002，差异极显著，45个循环的平均值普遍比40个循环的平均值高0.35-1.22，而SD和CV均无显著性差异。
    （4）Ct值40以上的结果：仅有一个值为40.53。
    试验结论：
    通过增加循环数不能提高试剂本身的最低检测限和对低浓度样品的检出率。循环数增加是否会增加非特异扩增的概率，本次试验未进行验证。
三、再多说几句
1.每个qPCR试剂盒在上市前应该按照行业统一的标准进行各种指标的系统评估，试剂盒生产厂家应该提供这些参数供客户进行选择和验证。检测实验室也应该具备对试剂盒进行性能验证的能力。
2.一个qPCR试剂盒的核心是引物探针设计、酶、反应体系和最优的反应条件，试剂盒生产厂家应该从根本上去改进自己的试剂盒而不是做一些文字游戏。
3.对于检测来说，qPCR试剂盒只是其中的一个环节，如果想得到可靠的检测结果还需要对采样、运输、保存、处理、提取和扩增的每个环节进行质量控制（检测全流程质量控制）。实验室的检测人员也不要抱有解决了qPCR试剂盒的问题就解决了检测中所有问题的幻想。
内容原创作者:  原博士

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