免疫荧光层析技术

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　　免疫层析技术因其简单、方便、易操作、快速，价格相对低廉，已广泛应用于即时检测（POCT）。随着POCT检测项目的增多和对已有项目检测定量、灵敏度、特异度等要求提高。
　　１免疫层析技术简介
　　免疫层析技术是在20世纪60年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法，利用胶体金、胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料、量子点等着色标记物，在层析时，标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线，以纤维膜上显色条带的有无、颜色深浅和反射光线来定性或定量，在即时检测（POCT）中应用极为广泛。免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜、检测线（T线）、质控线（C线）、吸水垫、聚氯乙烯（PVC）底板等部分组成，根据待检测物的大小和抗原抗体结合的方式，分为双抗体夹心法和竞争法。一种双抗体夹心法，主要检测多抗原位点的生物大分子；另一种为竞争法，主要检测半抗原、即不具备免疫原性的小分子化合物（如药物、毒素、糖类等）。
　　２免疫层析技术发展及应用
　　免疫层析技术关键在于依靠标记抗体的免疫标记材料，而纳米材料由于优越的信号放大作用，能达到良好的灵敏度和特异度而备受青睐。主要从胶体碳、量子点、稀土纳米材料、上转换发光技术和超顺磁性纳米材料以及适配体等方面进行介绍。
　　２.１胶体碳 与胶体金相比，胶体碳的优点包括更高的颜色强度，即更高的灵敏度和标记效率，动力学检测范围更广，成本低廉，制作工艺简单，可大规模生产且更环保，但由于其标记和封闭时间长，并未体现出对胶体金的绝对优势，故其商业化程度较低。何卓等利用碳纳米颗粒制作的胶体碳试纸条用于检测疟原虫，并可通过扫描检测带灰度值以定量。最近，YU等利用一种新的胶体碳材料氧化石墨烯作为标记物，成功制作出用于检测黄曲霉素Ｂ１的试纸条，肉眼最低检测限可达0.3ng／ml。材料学的进步能促进检测的进步，诸如碳量子点和石墨烯量子点等材料也是免疫层析研究中可以利用的标记材料。
　　２.２量子点 量子点被认为是免疫层析中最有前途的荧光半导体纳米材料，与一般荧光染料相比，量子点具有尺寸可调的荧光，发射光谱窄而对称，高量子产率，宽吸收光谱，荧光强度高，耐光漂白和稳定性好等优点。水溶性量子点表面富含羧基或氨基以用于连接蛋白质。表面是羧基的量子点被1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（NHS）激活，并且这些激活的羧基和抗体的氨基相连接。这些特性使得量子点是一个可以达到高灵敏度和同时对多种检测物定量的免疫层析标记物。为了检测样本中不同的物质，有两种不同模式的检测方法。第一种模式是不同的T线去检测与之对应的分析物；第二种模式是一条Ｔ线去检测不同的分析物。例如，第一种模式，TARANOVA等设计了一种“交通信号灯”式的竞争性免疫层析方法，他们使用的多色彩的量子点作为标记物以同时检测牛奶中的氧氟沙星、氯霉素和链霉素，有625、585、525nm的３种不同发射峰的水溶性量子点被用于制作成３条不同颜色的检测线，分别是红色、黄色和绿色。在这种“交通信号灯”式的检测方法中，氧氟沙星、氯霉素和链霉素的检测限分别达到了0.30、0.12、0.20ｎｇ／ｍＬ，比酶联免疫吸附试验（ELISA）方法的检测限低了80～200倍。第二种模式，WANG等设计的一种以多色量子点为标记物的双抗体夹心免疫层析试纸条，这种试纸条只有一条Ｔ线，可同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原，检测限分别为3、2ng／mL。虽然量子点有诸多优点，但量子点也有缺点。例如，量子点在生物环境下化学性质和胶体性质的不稳定性可能会导致定量不准确。所以，最近已经有几个研究小组都已经开发了一种新的方法，把量子点包被到纳米颗粒表面或里面形成量子点微球，以提升其化学和胶体稳定性，并借此通过量子点的数量来扩大检测信号。丁乔棋等以羧基化CdTe/ZnSe量子点荧光微球为标记物制作的免疫层析试纸条检测牛奶中的氯霉素，检出限为0.1ug/L。量子点提高稳定性后，在多联检测上是很有前途的纳米材料。


　　２.３镧系元素 镧系元素是第57号元素镧到71号元素镥共15种元素的统称，用符号Ln表示，镧系元素和免疫层析技术相结合形成时间分辨荧光免疫分析层析技术（TRFICA）。与传统荧光标记物相比，镧系元素有独特的荧光特性：荧光寿命长，激发光和发射光的波长差（stokes位移）大，激发光谱和发射光谱无交叉，特征峰非常尖锐，标记物体积小（原子标记），标记物不会影响被标记物（尤其对蛋白质的影响小）的空间立体结构，保证了被检物质的稳定性，且可以实现多位点标记等特点。通过有效利用波长分辨和时间分辨技术排除非特异荧光，实现了高信噪比和灵敏度，以时间分辨技术测量特异荧光，对待检物质进行定量分析，解决了普通荧光分析中材料和样品中非特异荧光产生的高背景问题，其中Ｅｕ最为常用。LIANG等用Eu3+敖合的聚苯乙烯微球作为标记物制作的时间分辨荧光免疫层析试纸条以检测甲胎蛋白，该研究小组是以T线荧光值/CＣ线荧光值（HT/HC比率）来定量检测甲胎蛋白，以HT/HC比率来定量可以消除试纸条之间的固有异质性和检测标本的基质效应，使得结果准确性和重复性更好。最后该小组检测甲胎蛋白的线性范围达到1.0～1000.0IU/mL，最低检测限达到了0.1 IU/mL，与商用的化学发光试剂盒结果符合性优异。同样地，TRFICA一样可以实现一个试纸条检测多种物质。WANG等用竞争法，在NC膜上划了１条C线和３条T线，３条T线分别用于检测３种不同的β－受体激动剂：盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。理论上讲，TRFICA的灵敏度可以达到10～18mol/L，但在现有的研究中还不能达到，所以以后的研究仍须进一步发挥其高灵敏度的优势。
　　２.４上转换发光技术 上转换发光技术即以稀土金属元素（主要是镧系）构成的纳米或亚微米颗粒作为标记物的免疫层析技术。上转换发光材料在红外激发光下可发射出不同波长的可见光，使其具有抗光漂白能力强、反斯托克斯位移宽、毒性低、背景荧光干扰小、发光特性稳定等有点，在免疫检测中可提高灵敏度和信噪比，尤其适用于复杂样本的检测。雷萌等研制基于上转换纳米荧光快速定量检测降钙素原的免疫层析检测技术，最低检测限为0.02ng/mL，线性范围为0.05～44.00 ng/mL。基于上转换发光尤其适用于复杂样本的检测的特点，可以开发基于上转换发光的多联检测试纸条。
　　２.５磁性纳米微球 在传统的免疫层析方法中，定量主要依赖于测试仪去读取可见光或荧光，但这种方法的劣势就是只能检测到膜表面及以下10μｍ这部分的可见光或荧光。然而，通常NC膜的厚度一般是数百微米，分析物在层析时，从膜表面到底部均有指示物质的分布，这样就造成了多达90％或以上的指示物质未被肉眼或光学仪器所测量到，这对于检测的灵敏度是个极大的损失。而基于超顺磁纳米颗粒（MNPs）作为标记物的免疫层析方法，利用磁信号分析仪（MAR）可以实现对膜上信号的完整读取，不用去考虑膜的厚度问题，这样可以把灵敏度提高10～1000倍，而且试纸条在长时间放置后磁信号并不会有明显损失，生物材料中有鲜有磁信号，因此，对试纸条的干扰很小，所以这样的方法可以达到很高的灵敏度、准确性和稳定性。基于超顺磁纳米颗粒的免疫层析法，定量的检测模式有两种：第一种模式是在振荡的磁场中，用巨磁阻传感器去检测Ｔ线上所有磁性纳米颗粒的磁化饱和强度；第二种模式是在磁场中，利用磁信号检测仪去扫描NC膜上各个部分以得到磁通量。然而两种模式使用的检测仪器不适宜普及，WU等利用智能手机的相机和成像技术把质控线和检测线上的磁珠抗体颜色强度转化成数字信号来给尿液中的可卡因定量。GONG等也利用磁性微球建立了同时检测心肌肌钙蛋白Ｉ和肌酸激酶同功酶（CK－MB）的方法，最低检测限达到了0.049 ng/mL和0.085 ng/mL。这也为以后用磁性微球建立免疫层析的方法做出了一定的指引，可以利用身边的智能设备如手机等作为检测设备，做到更加高效快速的检测。
　　２.６适配体 传统的免疫层析法用抗体作为标记物和捕获物，现在随着指数富集的配基系统进化技术（SELEX）的应用，配对的适配体也逐渐筛选出来。适配体相对于传统的抗体来讲，具有诸多的优势：筛选周期短，亲和力和稳定性高，特异度强，重复性好，易于合成和修饰，成本低，易于保存，无免疫原性和毒性，可与细胞、重金属、蛋白质、细菌和病毒等靶标适配。AHMAD RASTON等利用SELEX筛选丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源适配体结合胶体金技术检测丝氨酸蛋白酶抑制剂，在溶液和血清中的检测限分别达到了0.137nmol和0.105nmol。WU等也首次用适配体检测玉米赤霉烯酮，检测限达到了20 ng/mL。由于适配体的诸多优点以及SELEX技术的逐渐成熟应用，在免疫层析上用适配体来代替抗体检测是一个好的方向。
　　介绍了免疫层析法的设计组装、反应原理及主要标记物种类和在POCT的应用，包括床旁检测、食物检测和环境监测等。经过几十年的发展，从最初的胶体金，到后来的胶体碳、量子点、稀土发光材料、上转换发光材料、超顺磁纳米微球和适配体等，以及本文中还未提及的脂质体等材料，各种材料都被人们发现并运用，使得免疫层析得到长足的发展和广泛应用。定量、提高灵敏度、多联检测和环保是未来依然要努力的方向。总之，多种多样的标记材料已经在免疫层析法上有所使用，也各自展现了自己的优势和劣势，应进一步对此深入研究，以使得其更好地应用于临床检测、食品检测和环境监测等。

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