化学发光免疫分析(CLIA)

二维码

来源：知乎
化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光与免疫分析有效结合的一种检测方法，化学发光分析是根据免疫反应情况，待免疫反应完之后加入酶或氧化剂等发光底物，发光底物经过氧化会形成处于激发状态的中间体，通过发射光子来释放能量，以达到稳定状态。而免疫分析是在抗体或抗原之上利用标记物进行直接的标记，标记物为化学物质或酶，待抗体或抗原发生反应后，会产生带有抗体免疫的复合物。

化学发光免疫分析的原理
化学发光免疫技术的原理是以化学发光剂对抗体或抗原进行直接标记，待磁颗粒性、抗体或抗原发生反应之后，在磁场的作用下，分离处于游离状态和结合状态的化学发光剂，将发光促进剂加入到结合状态的部分，使其进行快速的发光反应，并以定性或定量的方式检测处于结合状态的发光强度。化学发光免疫技术系统具有操作较为简单，结果较为准确可靠，且自动化程度较高以及试剂储存的时间较长等优点。

化学发光免疫分析的类型
化学发光免疫技术在临床检验中，主要分为酶催化化学发光的免疫分析、直接标记发光物质的免疫分析以及电化学发光的免疫分析。
酶催化化学发光的免疫分析是通过抗体或抗原在标本中发生反应之时，采用发光的酶作为标记物。
直接标记发光物质的免疫分析是采用吖啶酯对体或抗原进行直接标记，待抗体或抗原发生免疫反应后会产生一种复合物，加入氢氧化钠和带有双氧水的氧化剂后呈碱性，出现发光、分解等现象。
而电化学发光的免疫分析过程包括化学反光和电化学，将三丙胺作为电子供体，对抗体或抗原用三联吡啶钌进行标记，在电场的作用下，通过电子转移而产生发光反应。

化学发光免疫分析的发展
       化学发光免疫分析技术的首次提出是在20世纪90年代末。传统的化学发光免疫分析仅能满足低敏感度等领域的检测，如果要完成大量复杂样品以及低分毒样品的测定分析，需要通过灵敏性高、特异性明确的CLIA检测方法。同时，因为化学能向光能的转化过程转化率相对较低，进而导致产生的光信号强度不够，无法完成对灵敏度要求较高的检测。故为达到提高分析特异性以及灵敏度的目的，需要通过降低背景干扰同时增强信号强度来实现。经过40余年的发展推进，目前化学发光免疫分析检测体系已经十分健全。近年来，通过频繁对基于磁性微粒子（ MPs）以及金纳米粒子（ Au NPs） 的化学发光免疫分析的研究，在提高分析检测灵敏度方面取得了重大进展。
1 基于磁性微粒子（ MPs）的化学发光免疫分析：在免疫分析过程中，相对较为繁杂且耗时的步骤为分离抗原-抗体免疫复合物，这也往往是造成性价比低下的因素。在CLIA中，目前的一种有效方式为选取磁性微粒子作为免疫反应及分离的固定载体。其中与抗体相连接的粒子主要为MPs，其机制为通过免疫反应的途径达到对靶物质的捕获，进而形成免疫复合物，同时借助外磁场，实现对免疫复合物的滞留，完成分离，进而样品中基质的干扰因素得以清除，达到降低背景干扰的目的。
将抗原相对应的抗体修饰与MPs表面，待发生在抗原、酶标抗体与固定在MPs上的抗体间的双抗夹心免疫反应完成后，再借助磁场的作用完成对免疫复合物的分离，然后加入发光底物，产生光信号用于检测，此为多數化学发光免疫反应的基本原理。相关研究报道了基于磁性微粒子（ MPs）的化学发光免疫分析检测人体血清中前列腺特异性抗原（PSA），结果显示相比于传统的微孔板CLIA，由于MPs的加入，在减少反应试剂剂量以及反应时间的同时，还达到了降低背景干扰，使灵敏度得以提高的目的。
2 基于金纳米粒子（ Au NPs） 的化学发光免疫分析：在实际检测过程中，高灵敏度对于CLIA检测方法的意义十分重大。近几年，由于化学发光研究中纳米粒子的引入，促进了化学发光的基础与应用研究的迅速发展。譬如目前已经广泛应用建立高灵敏度CLIA检测方法中的金纳米粒子、二氧化硅粒子以及多种复合结构纳米粒子等。
在化学发光免疫反应中，因为 Au NPs方法具有对鲁米诺（Luminol）发光体系中自由基产生以及电子的转移的产生促进的作用，促进了化学发光反应的增强，进而达到提高检测灵敏度的目的。相关研究表明，Au NPs方法对鲁米诺（Luminol）-H2O2发光反应信号强度的提高程度大约为4倍。虽然包含有抗体的Au NPs信号强度相对较弱，但是相比于Au NPs存在的发光信号强度仍然显著增高，由此可确定Au NPs方法对鲁米诺（Luminol）发光反应具有促进作用。为了达到提高检测灵敏度的目的，在增强化学发光信号强度这种直接方式以外，通过对Au NPs进行修饰也有显著效果。因为Au NPs是一种催化反应的载体，较多的酶标抗体可在其表面修饰，可增强酶促反应以及光信号强度。
3 化学发光共振能量转移免疫分析：化学发光共振能量转移（CRET）基于供体基团激发状态下偶极子介导的能量发生从供体向受体的转移。光子不直接参与此过程，无辐射。CRET具有降低信号背景以及提高检测灵敏度的作用，缺陷在于能量转移的效率并不明显。
为了实现对能量转移效率的提高，常在CRET中应用石墨烯、氧化石墨烯及无定形碳等材料。且研究资料显示，无定型碳对光能的吸收效率显著高于石墨烯和氧化石墨烯，说明无定型碳能够提高能量转移效率，是一种更好的能量受体。
化学发光共振能量转移免疫方法的优点在于可省去清洗未结合的抗体与分离免疫复合物的步骤而进行直接检测，相比之下操作过程更为简洁迅速，可推广发展。

化学发光免疫分析和酶联免疫吸附法的对比分析
酶联免疫吸附法属于一种定性法，其原理是经试剂使抗原、抗体结合某种固相载体表面，且保持其免疫活性，促使抗原、抗体和某种酶连接为酶标抗原以及抗体，能够保留免疫活性以及酶的活性。
二者反应原理不同，所以具备不同灵敏度以及检测限。两种方法检测过程也存在差异。酶联免疫吸附法需要进行手动加样、明确孵育时间和手动洗板等，受到操作人员手法不同影响，引起结果存在差异。而化学发光免疫分析检测过程均在化学发光设备内完成，可有效避免交叉感染等问题对结果准确性的影响。检测过程可实现自动化及标准化，有效避免人为因素对检测结果准确性的影响。
       从"化学发光免疫分析法检测乙肝病毒感染性标志物的临床应用分析"，一文得出的实验数据，可以看出：相比于酶联免疫吸附法，化学发光免疫分析法具有更高的敏感度，和检测准确度。
       文章“化学发光免疫分析法与酶免疫法检测艾滋病抗体时的对照分析”也得出结论：化学发光免疫分析法的检测效率和检测稳定性更佳，优于酶免疫法。
       除此之外，化学发光免疫分析法还有检测线性范围宽，安全性较高，不污染环境，标记物可长期保存，操作简便以及便于实现自动化等特点。

Biorbyt拥有适用于化学发光免疫分析所用的抗体、蛋白（见下表），用于肿瘤标志物检测，激素分析，传染性疾病及心脏疾病分析，细菌、维生素、免疫球蛋白、细胞因子和酶的分析等。



参考资料：

1，包焕平.试论临床检验中应用化学发光免疫技术.卷宗，2015.4
2，谢慧.肿瘤标志物检测中如何应用化学发光免疫分析.健康必读,1672-3783（2020）01-03--01
3.https://www.fx361.com/page/2020/0704/7612988.shtml
4.https://www.fx361.com/page/2021/0603/10367610.shtml

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/543808011