循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞，被认为与肿瘤转移、治疗耐药、疾病进展和预后密切相关。CTC检测具有微创、可动态追踪等优势，因此是极具潜力的一类标志物。但CTC检测的难点在于数量稀少，不均一。 早期肿瘤患者血液中的CTC可能少于1个/mL，即便在晚期患者中也只有个位数到十几个/mL。同时，CTC在表面标志物、大小、变形能力、密度和形态上都具有高度异质性，且常与白细胞发生重叠。传统依赖EpCAM等上皮标志物的检测方法，容易漏掉低表达上皮标志物的CTC，而单纯依赖物理性质的分选方法，又容易受到白细胞背景干扰。 近日，美国多个高校和研究机构合作在杂志npj Biosensing上发表了一篇题为 “Circulating tumor cell detection in cancer patients using in-flow deep learning holography”的文章。文章中，作者提出了一种新的CTC检测策略，将惯性微流控富集、流动中数字全息显微成像（DHM）、深度学习图像识别和双通道免疫荧光表型分析结合起来，在细胞连续流动过程中实时识别CTC候选细胞。该平台在临床队列中显示，转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的CTC计数高于健康对照，并且患者层面的假阳性率约为1 cell/mL。约三分之二被识别出的CTC为EpCAM阴性但PSMA阳性，提示传统单纯依赖EpCAM的CTC检测可能会漏掉相当一部分前列腺癌相关CTC。
图片来源：npj Biosensing 主要内容 高通量微流控CTC检测集成平台概述 研究所提出的平台集成了三种技术，全血样本先经锯齿状惯性微流控芯片，用于从全血中富集稀有细胞并去除大量血液背景；随后样本进入第二个微流控通道，在流动中利用数字全息显微成像系统以及双通道免疫荧光检测同步采集细胞的全息图和免疫荧光信号（如下图）。 结果显示，第一步的微流控芯片可去除超过99.999%红细胞和约99.6%白细胞，同时保留约95%癌细胞。整体而言，这一步带来超过100倍的CTC富集效果。
微流控CTC检测集成系统概述。图片来源：npj Biosensing 微流控CTC检测集成平台的原理及性能 数字全息显微成像（DHM）与传统明场图像不同，DHM通过记录样本光与参考光干涉信息，能够同时获得振幅和相位相关信息，因此可以反映细胞的光学厚度、三维形态和折射率相关特征。作者使用405 nm脉冲激光，在细胞连续通过微流控通道时采集全息图。全息图随后进入深度学习模型，模型对每个视野生成概率热图，标记潜在CTC位置。与此同时，488 nm激光激发免疫荧光信号，通过两个光电倍增管通道读取细胞的标志物表达。在此过程中，集成平台的背景逐级削减，极大控制了系统的假阳性概率（如下图）。 这套微流控CTC检测集成平台使DHM与免疫标志物相结合，DHM负责捕捉细胞形态和光学结构，免疫荧光负责提供肿瘤相关分子证据，二者结合显著提高了CTC检测的准确率。
集成平台的逐级背景削减过程。图片来源：npj Biosensing 小规模临床验证 作者使用大量健康血细胞作为阴性背景，用多种癌细胞系作为阳性参考，让模型学习癌细胞相对于正常血细胞的形态偏离。最终用于训练的精选数据包括590万张健康细胞图像和200万张癌细胞系图像。结合临床晚期癌症中CTC大约10 cells/mL的预期丰度，作者选择0.5作为操作阈值。在此阈值下，加标实验中的真实阳性率约为60%，假阳性率低于0.1 false positives/mL。估算临床的阳性预测值约为0.98。 作者在一个小规模临床队列中验证了该平台。患者组包括 13名转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）男性患者，健康对照组包括 8名无已知癌症诊断的男性供者。PSMA作为前列腺相关肿瘤标志物，同时检测EpCAM作为上皮表型标志物。最终CTC判定标准为细胞必须同时满足DHM模型置信度超过0.5 且 PSMA阳性。结果显示，mCRPC患者的CTC计数明显高于健康对照，中位数分别为 12.5 cells/mL 和 1.5 cells/mL（如下图）。结果表明该平台可以在真实临床样本中区分晚期前列腺癌患者与健康对照。
该模型在临床队列中的检测率。图片来源：npj Biosensing 患者队列中，EpCAM阴性CTC比例较高 作者发现，在患者队列中，EpCAM阴性CTC比例较高，PSMA阳性细胞中只有37%同时为EpCAM阳性。约三分之二被该平台识别出的前列腺癌相关CTC属于 PSMA阳性、EpCAM阴性。这一结果表明，如果检测平台过度依赖EpCAM，会系统性漏掉EpCAM低表达或阴性的CTC。对于前列腺癌而言，PSMA提供了更具组织相关性的标志物，而DHM则提供了不依赖抗原的形态学支持。二者结合可覆盖传统EpCAM平台容易遗漏的细胞亚群。 总结与讨论 这项研究提出了一种新的CTC检测平台，将微流控富集、数字全息显微成像和免疫荧光确认整合在一起，显著降低了红细胞和白细胞背景，降低了检测的假阳性率。DHM提供了无标记、非破坏性的形态和相位信息，有望捕捉抗原表达之外的CTC特征，结合免疫荧光提供的肿瘤相关分子证据，帮助降低纯形态识别中的假阳性。结果显示在mCRPC队列中，PSMA与DHM结合识别出大量EpCAM阴性细胞，提示该平台可弥补EpCAM依赖方法的漏检。 但这项研究也有局限性。首先，临床队列只有13例mCRPC患者和8例健康对照；其次，还需要纳入良性疾病、炎症、感染等疾病对照来检验假阳性来源。下一步需要开展跨肿瘤类型、跨分期、预设阈值的前瞻性验证，并评估CTC计数与影像学反应、无进展生存和总生存等临床终点的关系。总之，对于未来液体活检而言，这种从单一抗原捕获走向“形态-光学-分子多模态融合”的思路，可能会成为CTC检测重新获得临床关注的重要路径。 |
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