单管法CASTSA平台！CRISPR系统触发qPCR扩增，极大提高特异性

作者团队开发了一种名为CASTSA的单管法核酸检测平台，将CRISPR-Cas12a系统的高特异性识别能力与qPCR的高灵敏度扩增能力在单一反应管内整合，从而规避了预扩增步骤。CASTSA的反应机制分为两个兼容的步骤，‌CRISPR-Cas12a的特异性顺式切割‌和‌末端特异性定量PCR扩增（tsPCR）‌。

首先，在crRNA的引导下，LbaCas12a核糖核蛋白（RNP）复合物特异性识别并结合到目标核酸序列上。当存在PAM序列时，Cas12a酶会在特定位点切割目标双链，‌生成带有特定5'末端的单链片段‌。接下来，一个特殊设计的‌末端特异性引物（TSP）‌通过其特异的末端区域（T2c）结合到Cas12a切割产生的子靶序列上。TSP引物的延伸和自身的结构设计（包含一个阻止非特异性延伸的Spacer 18阻断剂）会引导形成一个‌自折叠的发夹结构‌。这个不完全的发夹结构进一步延伸，并被一个与Uc 相互补的上游引物（UP）结合和延伸，最终形成一个‌包含标准qPCR引物（UP和T3P）结合位点的功能性qPCR模板‌。至此，标准qPCR才得以启动和扩增。只有当Cas12a RNP成功识别并切割了目标序列且TSP引物结合到切割产物上并正确启动发夹模板形成这两个事件同时发生，扩增信号才能被激活（如下图）‌。这种双重保险机制有效防止了预扩增阶段的非特异性扩增。

tsPCR 步骤的扩增效率对 TSP 浓度非常敏感，低浓度的 TSP 会降低扩增效率，而高浓度则会增加 T1s 和 T2c 区域之间非特异性杂交的风险。实验结果显示，10 nM 的TSP为最佳浓度，能产生最高的效率。在此浓度下，两步 CASTSA 的 Ct 值与模板浓度的对数呈线性关系（图a，b）。

作者尝试将tsPCR 和 CRISPR-Cas 切割整合到单管中。然而，两种反应的缓冲液组成，特别是镁离子（Mg²⁺）的浓度不同。过量的Mg²⁺会导至 PCR 中的非特异性扩增，而Mg²⁺浓度不足则会抑制 Cas12a 的活性。作者测试了2 mM至10 mM的Mg²⁺浓度。结果显示，‌5 mM Mg²⁺‌能够在保证Cas12a活性的同时，避免PCR产生非特异性扩增，是单管反应的最佳平衡点（图c）。

为了进一步提升检测的实用性和实现即时检测（POCT），研究团队设计并构建了一个‌基于激光诱导石墨烯（LIG）的电化学生物传感器平台（图a）‌。这种‌高灵敏电化学检测‌，有效消除了复杂样本基质在荧光检测中可能产生的背景干扰，提高了灵敏度。为了解决非特异性吸附的问题，作者还使用了‌独特的四电极阵列设计（图e）‌，其中三个工作电极修饰了特异性探针，第四个作为未修饰的空白对照电极，用于实时扣除背景和非特异性吸附信号，大大提高了测量的准确性和重复性（图f和g）。

作者使用临床样本中提取的各种 HPV 亚型的 DNA 基因组来验证 CASTSA 系统的特异性。结果显示，靶向HPV 16的CASTSA系统‌能够高特异性地区分HPV 16与HPV 18、33、45、52等其他高风险亚型‌，在各种测试实验中均无交叉反应（图a,b,c）。相比之下，针对同一区域的传统qPCR方法对所有测试亚型都产生了非特异性信号（图d），而传统的带有预扩增步骤的常规 CRISPR-Dx 方法，HPV 16 与其他亚型之间的荧光强度差异有所减小（图 e），说明其特异性也因预扩增步骤的局限性而显著降低。这证明了CASTSA在准确识别具有高度序列相似性的基因亚型的优势。

作者使用人工合成的HPV 16模板测试CASTSA 系统的敏感性，结果显示，CASTSA显示出优异的灵敏度。在10 pM至1 fM浓度范围内，Ct值与模板浓度的对数呈良好的线性关系（图 f）。结合电化学检测时，CASTSA检测限（LOD）达到‌18拷贝/反应（图h），超过了基于荧光分析的灵敏度（LOD 为 30 个拷贝/反应）。

为了验证CASTSA的临床可行性，研究者收集了30份临床样本，包含20份HPV 16阳性和10份阴性的拭子样本。对样本进行了简单的离心处理后，这些样本在单管 CASTSA 中进行分析，包括使用荧光和电化学两种读出方式，并与临床金标准方法TaqMan实时定量PCR（q-PCR）进行比对。结果显示，‌CASTSA的诊断结果与qPCR完全一致（图i）‌，所有健康样本均显示阴性信号，证明了其在临床样本中检测的高特异性和可靠性。

作者开发了单管法CASTSA平台，该方法基于 CRISPR/Cas12a 系统和 qPCR，旨在消除传统 CRISPR-Dx 方法中预扩增步骤中固有的非特异性扩增现象。在 CASTSA 中，扩增仅在 Cas12a 核蛋白特异性识别并切割目标后才开始，从而产生一个游离的 5' 端。设计的引物TSP，通过自身折叠和延伸将切割产物转化为 qPCR 模板。即使 TSP 与具有部分同源性的非目标序列结合，如果没有顺式切割，它也无法延伸或形成具有功能性的发夹结构，从而确保了高特异性，避免了非特异性扩增。通过与高灵敏、便携式的LIG电化学传感平台相结合，CASTSA实现了对HPV 16的高特异性、高灵敏度（LOD 18拷贝/反应）检测，并在临床样本验证中展现出与金标准方法一致的结果。

尽管CASTSA在特异性方面表现出色，但其扩增灵敏度相较于独立的tsPCR略低。作者分析这可能是由于CRISPR系统的顺式切割效率无法达到100%，以及为了兼顾Cas12a与聚合酶活性而对Mg²⁺浓度进行的折中优化所致。未来的研究将致力于提高CRISPR的切割效率和进一步优化反应条件以提升灵敏度。CASTSA未来的发展方向，包括进一步简化反应体系，以及开发‌多重检测‌能力。通过设计不同的crRNA和相应的TSP/UP引物组，CASTSA有潜力在一个反应管内同时检测多种病原体亚型或突变，而无需依赖多种Cas蛋白变体或专用的高通量平台，这为需要在现场进行精确亚型分型和突变检测的应用场景提供了极具前景的技术平台。这项研究为开发更精确、更便捷的即时核酸诊断工具，特别是在需要精确区分基因亚型的复杂诊断场景中，提供了重要的思路和技术方案。