当电流被施加到含有带电片段的介质上时，这些片段将向相反的电荷迁移，这是一个简单的物理定律规定。 它们的速度取决于它们所通过的介质，以及其他特性，如存在的片段的大小，在这些因素的影响下，它们彼此之间会分离，这就是琼脂糖凝胶电泳等电泳技术的基础。目前，这些技术在整个生命科学领域被广泛的使用。 在这篇文章中，我们将考虑琼脂糖凝胶电泳是如何工作的，如何解释它的结果，以及它能够起什么作用。 电泳是一种利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的物理特性（如大小和电荷）来分离它们的技术。 琼脂糖凝胶电泳是一种电泳形式，用于根据核酸（DNA或RNA）片段的大小进行分离。当施加电流时，带负电的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向凝胶带正电的一端迁移，较小的片段迁移较快。由此产生的条带可以用紫外线（UV）光来观察。 然而，RNA[1]往往会形成二级结构，而且有时同一个片段会有多个不同的种类，这会影响其迁移的方式。因此，观察到的条带并不总是代表它们的真实尺寸，图像也很模糊。 在这种情况下，琼脂糖天然凝胶（条件不会破坏分析物的自然结构）往往不用于分析RNA的大小，尽管它们可以提供数量和完整性的估计。替代方法包括RNA印迹法和变性琼脂糖凝胶电泳[2]，它们使用的条件能够破坏二级结构。 琼脂糖凝胶也可用于根据蛋白质的大小和电荷来分离蛋白质[3]（与DNA/RNA不同，蛋白质电荷根据所含氨基酸的不同而不同）。然而，由于琼脂糖凝胶的孔径较大，蛋白质通常在聚丙烯酰胺凝胶上分离，而聚丙烯酰胺凝胶的孔径较小，为小的蛋白质分子提供更大的分辨率。 因此，在本文的剩余部分，我们将重点讨论DNA琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖是琼脂的一种成分，它形成了一个由螺旋状的琼脂糖分子组成的三维凝胶基质，这些螺旋状的琼脂糖分子在超线圈束中被氢键固定，有通道和孔隙，分子能够通过。当加热时，这些氢键断裂，使琼脂糖变成液体，并允许它在复位前被倒入模具（图1）。
图1 | 琼脂糖凝胶中的孔隙形成和温度诱导的状态转变。 琼脂糖在凝胶中的百分比影响了孔的大小，从而影响了可能通过的分子的大小以及通过的速度。琼脂糖的百分比越高，孔径越小，因此能够通过的分子越小，迁移速度越慢。 在分子生物学实验室中，0.7~1%的琼脂糖凝胶通常用于日常的DNA分离，对0.2~10kb范围内的片段提供良好、清晰的区分。较大的片段可以用较低百分比的凝胶来解决，但它们会变得非常脆弱且难以处理，而较高百分比的凝胶会对小片段提供更好的分辨率，但很脆且可能凝固不均匀。 由于DNA在肉眼中是不可见的，在凝固过程中，一种夹层染料如溴化乙锭（EtBr）被纳入凝胶中。这与DNA结合，并在紫外线下发出荧光，从而使DNA片段可以被观察到。存在的DNA越多，条带就越亮。 与加载染料混合的样本被放置在凝胶的一端，凝胶被浸泡在运行缓冲液中。然后电流通过凝胶槽两端的电极穿过凝胶（图2）。
图2 | 琼脂糖凝胶电泳装置的图示。琼脂糖凝胶放置在缓冲液槽中，样品与加载染料混合后放置在凝胶一端的孔中，施加电流使带负电的DNA向正电极（阴极）移动。 当样品运行得足够远以获得足够的分离时，将凝胶从槽中取出并放在一个紫外光箱上。然后，夹层染料可以使样品条带可视化，并通过与已知条带大小的DNA marker进行比较来确定其大小。迁移距离和片段大小之间的关系是非线性的，增加了包括尺寸标记作为指导的重要性（图3）。
图3 | A）上面的插图描述了DNA电泳的典型结果。在左边，有一个尺寸标记，用来作为样品DNA片段长度（以碱基对为单位）的参考。标记的右边是三个样品。图片显示了较小的DNA片段如何在琼脂糖凝胶中比较大的DNA片段移动得更远。 B) 图片右侧的图表显示了DNA片段的大小与迁移距离之间的非线性关系。这是一条负的曲线，当DNA片段变大时，它们在凝胶中迁移的距离就会减少。 在选择、设置、运行和分析琼脂糖凝胶的过程中，有一些关键步骤[4]，我们现在将介绍这些步骤。 4.1、确定所需的凝胶百分比 0.7-1%的琼脂糖凝胶通常对大多数应用来说是足够的，但重要的是选择一个适合你的样品和预期片段大小的百分比。将琼脂糖粉末与用于运行凝胶的相同类型的缓冲液结合起来，加热使混合物融化，避免沸腾。 三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）或三硼酸-EDTA（TBE）[5]通常是首选的缓冲液，因为三酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液，可保持DNA去质子化并溶于水。EDTA是一种螯合剂，能使可能损害被分析的DNA的核酸酶失活。 4.2、凝胶浇注 选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳子，为所有样品和marker提供足够数量的孔，以及容纳每个待装样品数量的孔容量。用铸造框架或胶带固定模具的两端，以便在凝胶凝固时将其固定。 在模具的底部加入DNA夹层染料，如果使用的是EtBr，通常浓度为0.2-0.5 μg/ml。EtBr是一种诱变剂的证据目前仍有争议，但因此，许多实验室已经转而使用替代品[6]，如GelRed。 加入凝胶，注意不要过度填充模具，并确保夹层染料均匀混合。凝胶太热时不要倒入，否则模具可能会变形或破裂。 4.3、将样品/marker与加载染料混合 加载染料具有多种功能，它们可以让用户看到他们原本无色的样品在哪里，使其更容易将样品准确地移入孔中，从而减少孔间样品交叉污染的可能性。 当凝胶运行时，染料与样品一起迁移，使用户能够知道样品在凝胶中的位置，并防止样品跑得太远而流失到缓冲液中。没有加载染料的DNA样品在加载时也会倾向于分散到运行缓冲液中，因为它们的密度较小。 因此，大多数加载染料含有甘油或Ficoll，这使得样品-染料混合物更密，所以它沉淀在孔的底部。溴酚蓝是一种流行的着色剂选择，但有些也含有额外的染料，如二甲苯氰醇。虽然可以购买加载染料，但许多实验室选择自己制作。 如果你的样品量非常小（例如，少于5 μL），在这个阶段加入一点水可能是有利的，这样更容易有效和均匀地装载到凝胶孔。 同样，如果你预计某些样品中的DNA浓度比其他样品高得多，那么在这个阶段也可能有必要向这些浓缩样品的样品-染料混合物中加水。 如果你不这样做，在可视化过程中，这些条带给出的强信号可能会掩盖较弱的条带，或者需要对强条带进行过度曝光以观察较弱的条带，在凝胶图像上形成明亮、扭曲的区域。 4.4、凝胶装入 从设定好的凝胶上取下浇注框/胶带，并将其放入凝胶槽中，确保孔位于负电极（一般为黑色），将运行缓冲液（TAE或TBE）注入槽中，使凝胶被淹没。 小心地取下梳子，轻轻地将样品-染料（如果使用水）混合液移入孔中。尽量避免用移液器吸头接触孔的边缘，因为它们可能会破裂，使一个样品跑到下一个孔中。过量的孔会产生同样的结果。DNA的样本量过大也会在运行过程中减慢DNA的迁移。 装上标记marker，最好是在样品行的两端各装一个。凝胶不一定总是在一条完美的直线上运行，所以在两端各装一个marker可以更容易确定存在的片段的大小。有多种marker可供选择，并且标明了不同的尺寸，选择一个最适合你期望的尺寸。 4.5、凝胶运行 将盖子放在电极黑对黑、红对红的罐子上，并将电极插入一个电源盒，也是黑对黑、红对红，这与凝胶罐一起构成了凝胶电泳仪。 确保电极和盖子的方向正确，否则你的样品会从孔中倒流到运行缓冲液中。设定凝胶运行的时间和电压，120V、35分钟是一个很好的近似值，但是这应该根据所使用的凝胶比例和预期分离的片段大小进行调整，以获得良好的电分离。 在琼脂糖凝胶上施加电流会使其发热，电压越高，发热越多，所以当运行低百分比的凝胶时，最好使用较低的电压以防止熔化。 增加电压以使凝胶运行得更快是很诱人的，然而，这可能会导至【笑脸凝胶】，即带子在两端向上弯曲，使其难以确定正确的带子大小。这是指凝胶开始轻微融化，使条带运行不均匀。这也会导至条带出现涂抹状和不清晰的情况。 4.6、可视化 一旦样品在凝胶上运行了大部分（染料前部会使其可见），关闭电源。 戴上手套，轻轻地将模具中的凝胶从槽中取出，排掉多余的运行缓冲液，并将其转移到一个适当的容器中的紫外箱中，以便进行可视化。更换手套以防止凝胶或运行缓冲液中的夹层染料污染周围的表面、门把手等。 如果下游应用需要DNA片段，可以用手术刀小心地从凝胶中切除相应的条带，同时将其放在黑暗房间的紫外光箱上。确保你戴上紫外线面罩，并在灯箱开启时保持皮肤覆盖，以防止紫外线对皮肤或眼睛的伤害。 琼脂糖凝胶可以在暗室中的紫外光箱上进行观察，或者使用与相机相连的独立灯箱。 无论使用哪种系统，紫外光从下面照射凝胶，DNA条带由于与它们结合的夹层染料而发出荧光，可以用带有专门的紫外线过滤器的照相机来记录。 标记物marker有一份说明书，表明它们包括的每个条带的大小。通过将其与样品通道中的条带进行比较，可以确定条带的大小。样品之间DNA的相对数量也可以进行比较，因为较高的DNA浓度会产生较亮的条带。图4中显示了一个例子。
图4 | 从一个有肺部症状的病人的支气管肺泡灌洗液（BAL）诊断标本中提取的DNA的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶（2%）分析。 有许多原因可能需要分离DNA片段，其中许多在生命科学学科中广泛适用。 6.1、样品DNA的可视化 对DNA片段进行分离和可视化，以便让用户确定结果。 ➤ 样品中是否存在DNA：这可以确认，例如，DNA提取或PCR是否有效，因此在诊断测试中可以确定样品是阳性还是阴性。 ➤ 样品中DNA片段的大小：例如，如果进行PCR或限制性消化，带子的大小是否符合预期？这可以证实基因工程实验是否成功，或者可以表明是否存在基因插入、缺失[8]或重复区域[9]，这些可以作为某些遗传病的诊断工具。在为下一代测序准备DNA时，重要的是用于制备文库的片段DNA具有正确的大小，以便进行有效的测序。 ➤ 样品中DNA片段的数量：尽管有更精确的方法来进行精确的DNA定量[10]，如紫外线-可见光光谱，当在凝胶上运行样品时，产生的条带强度可以让人大致了解样品中相对于其他样品的DNA数量。 ➤ 样品的清洁程度：虽然在某些情况下，如运行全基因组DNA时，可能会出现污浊的条带，但一般来说，PCR或限制性消化会产生清晰的条带。扩散带或污点可能表明PCR条件或引物不理想，消化不完全或存在干扰性污染物，如DNA样品中的RNA。 6.2、用于纯化的DNA片段的分离 如果下游应用需要DNA片段，如克隆[11]，或在限制性消化后，可能需要将特定大小的DNA片段从总样品中分离出来。为了达到这个目的，消化或扩增后的样品可以在凝胶上运行，并将含有感兴趣的片段的凝胶部分切除。 在进行下游步骤之前，可使用清理工具和方案[12,13]将DNA从琼脂糖凝胶中纯化出来。 6.3、用于DNA印迹法的DNA片段的分离 DNA印迹法是一种用于检测样品中特定DNA序列的技术。为了做到这一点，DNA片段首先必须通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后才能对目标序列进行探测。 6.4、电泳迁移率测定（EMSA） EMSA[14]，也被称为凝胶移动性检测，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。例子可能包括促进或阻止基因表达的转录因子[15]的结合。 当一个蛋白质与一个DNA片段结合时，它将改变它在琼脂糖凝胶中的迁移方式，产生「移位」。因此，通过运行带有或不带有假定的DNA结合蛋白的不同DNA片段组合，可以确定何时发生了结合或没有结合，从而确定目标序列。 诊断科学编辑团队收集、整理和编撰，如需更多资讯，请关注公众号诊断科学（DiagnosticsScience）。 |
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