分子生物学中最重要的酶，DNA聚合酶发展简史

生物技术和IT很像，是“软件”和“硬件”共同作用。硬件是各种仪器和设备平台，软件则是各种酶和技术。同样和IT行业一样，硬件创新可能需要综合的团队，软件创新开发一个程序或者APP可能只需要一个人，但依然可以产生颠覆性的革命。无疑DNA聚合酶是分子生物学中最重要的酶，没有之一。所以现在简单说一下DNA聚合酶在NGS中的应用起源。

DNA聚合酶分为常温酶和PCR酶

常温酶有大肠杆菌DNA 聚合酶I 、T4 DNA聚合酶等。大肠杆菌DNA 聚合酶I 经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow fragment，小片段的分子量为34KD，称为Klenow (3’-5’ exo-) 。在NGS文库构建时，通常用Klenow fragment和T4 DNA聚合酶组合进行片段化后的DNA末端修饰。当然，如果是物理打断，末修体系中还要加入PNK修复断裂的磷酸基团。采用one-tube的建库方法，直接在体系加入taq DNA聚合酶一步完成末修加A，三步法则需要纯化，用Klenow (3’-5’ exo-)加A。

phi29 DNA聚合酶也是NGS用的较多，在单细胞基因组扩增中早期都是用它，无论是MDA、还是谢晓亮老师的MALBAC的方法。直到2017年，谢晓亮组发表的LIANTI方法，才替换了这个酶，用的是带T7启动子的Tn5转座子打断，然后用T7启动子体外线性扩增。

还有其它不同DNA聚合酶也有使用，比如Bst聚合酶，该酶具有很强的链置换能力，最适温度是65°C，常用于LAMP检测（环介导等温扩增反应）。而且，llumina测序仪在X Ten使用RPA技术之前，簇生成技术用的桥式PCR就是交替使用Bst聚合酶进行延伸反应以及使用甲酰胺（formamide）进行变性反应。

当然最重要还是PCR酶。PCR酶是耐热DNA聚合酶，分为两种普通耐热DNA聚合酶，以Taq酶为代表，PCR产物有A尾；高保真DNA聚合酶，以pfu DNA 聚合酶和KOD为代表。高保真的DNA聚合酶具有3'-5'外切酶活性可以消除错配，PCR产物为平末端。

目前NGS文库构建，即使普通的高保真DNA聚合酶都很少使用。因为在文库覆盖度、模板偏好性、GC bias等NGS文库对PCR酶有着最高要求，若非经过千锤百炼的酶难以胜任。

当然，分子生物学的发展，也包含着PCR酶的发展：

1973年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年PCR技术的真正诞生。

PCR相关专利一直是个巨大的摇钱树。话说当年Roche以30亿美元的天价收购了Mullis所在的Cetus公司以及PCR专利，可是当时Cetus还和当时的Perkin Elmers公司合作开发PCR仪器，所以部分PCR专利依然被坚持牢牢控制在PE公司手里（后来PE和ABI分分合合中，落入ABI手里）。至于PCR酶，尽管Roche在美国的天然Taq专利无效（见Nature 402, 709; 1999），罗氏公司仍然拥有重组版的Taq专利。

罗氏和赛默飞一直是PCR技术的领导者。当然PCR酶领域其它公司有不可忽视的贡献。Stratagene的Pfu酶一向都是研究人员心目中最好的高保真酶，2007年6月安捷伦科技(Agilent Technologies ) 收购了Stratagene后，也归入安捷伦名下。KOD是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis ，1995年 KOD上市后始终是东洋纺的拳头产品，就连赛默飞著名的Pfx DNA聚合酶也是一种从Thermococcus 菌株KOD中克隆得到的专利重组DNA聚合酶。

1996年美国ABI公司（或者说PE公司，这两个公司分分合合，有多年纠葛）研究出实时荧光定量PCR技术。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃, 而且采用了完全闭管检测, 不需PCR后处理, 避免了交叉污染。配以相应的荧光PCR仪, 整个PCR过程可实现自动化, 且耗时短, 操作方便, 较之传统的定量方法劳动强度小, 易于标准化和推广应用. 因而迅速在医学, 检验检疫, 军事, 农业, 科研等领域得到了推广应用。一开始的非特异性检测扩增序列的代表是SYBR Green I荧光染料。SYBR Green I只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在一个加入过量SYBR green 1荧光染料的体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。荧光染料的优势在于能监测各种双链DNA序列的扩增，无需设计探针，检测简单简便，成本低廉。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，对DNA模板没有选择性，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号，引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。所以DNA聚合酶对于定量PCR反应保持特异性的重要作用，ABI采用化学修饰Taq酶得到高度严谨的热启动Taq，从而有效减少了非特异扩增，提高荧光染料法做定量PCR的特异性。这就是当年著名的ABI的“金牌”酶：AmpliTaq Gold® DNA Polymerase。AmpliTaq Gold如其名，确确实实是ABI定量PCR试剂中的一块金字招牌。AmpliTaq Gold通过对Taq酶的修饰确保在95℃才激活，根本上防止了反应前非特异性扩增。AmpliTaq Gold对Thermus aquaticus Taq DNA polymerase进行化学修饰改造-通过这种改造，修饰成份可以封闭AmpliTaq活性位点，在95℃之后，这种修饰成份也就从AmpliTaq上释放出来，还原AmpliTaq扩增活性。这样就确保了DNA在完全解链的情况下才会开始PCR扩增反应。Qiagen的HotStarTaq也进行了相似的改造。

顺便说一下，SYBR Green的非特异问题，当然不是只有一条途径。所谓条条道路通罗马，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特异性，“曲线救国”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，发展出更特异更灵敏的荧光染料——SYBR® GreenER™ qPCR Reagent System。SYBR Green原属于Molecular Probes公司的专利，但随着Probes被并购进入Invitrogen。

如果说金牌酶是第一代工程酶的话，Phusion高保真酶就是第二代工程酶的典范产品。

Finnzymes公司（现已被赛默飞世尔科技收购）独辟蹊径，将双链DNA结合蛋白（紫色）与一种新型的具有校对功能的类热球菌酶（绿色）融合，形成了一种独特的高性能聚合酶——Phusion® DNA聚合酶。聚合酶与Sso7d DNA结合结构域融合，从而改善了保真度、速度和性能可靠性。

在Finnzymes公司没有被收购之前，Phusion由Finnzymes公司开发和生产，NEB来销售。2010年Finnzymes被赛默飞收购，归入旗下。2012年NEB推出Q5超高保真DNA聚合酶，它与Phusion类似，也是聚合酶与Sso7d DNA结合结构域融合。伯乐推出过类似的酶。

与常规的化学修饰或抗体热启动不同，Phusion热启动利用了一种独特的适体（aptamer）。这种分子通过非共价相互作用与聚合酶可逆结合，在室温状态下阻断其活性；进入循环过程后，一旦到达高温，适体就会立即脱落，DNA聚合酶激活。Phusion热启动版本不需要像金牌酶一样开始的时候要单独热启动10 min。

高保真酶的一个主要弱点是产量偏低，一个重要原因是在PCR过程中由于dCTP脱氨基生成dUTP，dUTP的累积会造成所谓"PCR poisoning"，抑制PCR反应，也阻碍高保真酶的校正功能，从而限制了酶的精确度和延伸模版的能力。Stratagene添加ArchaeMaxx™聚合酶增强因子，能将dUTP分解为无毒的dUMP和焦磷酸，从而解除dUTP累积造成的影响，可以显著提高产量、减少扩增时间并可扩增更长的模板。

在PCR buffer的配方也是有更多的改进，TMAC、甜菜碱、新材料新化合物PCR添加剂等层出不穷，甚至复合型PCR添加剂，极大地提高DNA聚合酶的性能,，降低GC bias。然而，目前生物医药领域所使用的大部分生物酶都只是天然存在形式，即使有些酶经过基因工程改造，但是由于酶分子自身的结构和功能限制，要想得到真正满足科研工作人员需要的产品，却是一件费时费力的事情，而且常常达不到预期的要求。

正是因为如此，Kapa公司（被罗氏收购）利用“直接进化（directed evolution technology platform）”的专利技术平台上来筛选和生产高品质的生物酶，异军突起，生产了新一代的PCR酶。

直接分子进化又叫高通量分子进化（High-throughput Molecular Evolution），是运用遗传，基因工程，生物信息学等技术来在分子水平上设计真正满足不同实际要求的生物酶。无论是自己的体验，还是各种文献的报道，kapa HiFi Hot start Ready mix一直是最好的NGS文库构建酶。Kapa 2G Fast Multiplex也是一种经济高效的多重PCR文库构建酶，在遗传突变检测应用最为广泛，不过在检测低频突变时，更推荐Qiagen的那款。

DNA聚合酶的进化，还在继续。Kapa、赛默飞公司等仍在运用基因工程的手段改造DNA聚合酶，筛选更好的酶。另一方面，科学家在自然界也会找到更多新颖的DNA聚合酶，如NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上；华中科大在深海火山的病毒中第一个不需要引物的DNA聚合酶……从Taq酶起，一些极端环境就是盛产精品，我们有理由相信以后会发现更多惊喜。